高效液相色谱-串联质谱法测定禽肉中氟吡菌酰胺残留量的研究

朱亚琼

品测(上海)检测科技有限公司， 上海 201108

我国是世界上最大的农业国之一，据《2021年国民经济和社会发展统计公报》报道，全年粮食类种植面积达到11 763万公顷，比上年增加86万公顷。中国在农药使用量和生产量上都位居世界第1位[1]。近年来，农药品种不断增多，大量的农药施于农田，给农产品造成直接污染的同时，一部分残留在人类赖以生存的生态环境中，残存于土壤、水源、大气以及农作物中，对人类、家畜(动物性食品)及环境产生负面影响[2]。氟吡菌酰胺是一种琥珀酸脱氢酶抑制剂，它可以选择性地抑制线虫线粒体中的呼吸链复合体Ⅱ，从而导致线虫死亡，具有低毒安全，杀菌谱广等特点，既可用于防治灰霉病、白粉病、菌核病以及念珠菌属引起的病害，又对线虫有较好的防治作用[3]。国标GB 2763—2021[4]对动物源性食品中氟吡菌酰胺制定了限量要求，但目前尚未出台针对动物源性食品中氟吡菌酰胺的检测方法或相应的研究报道，因此亟需开展一种高效、简便，同时能够准确地定性和定量的检测方法。本文以禽肉为研究对象，优化提取溶剂和净化方法，比较了2种检测器的灵敏度，得到适用于禽肉基质的检测方法。

目前有大量文献针对植物源性食品中氟吡菌酰胺检测的相关研究。其中提取溶剂一般选择：乙腈、酸化乙腈、乙酸乙酯、丙酮和正己烷等，净化方式大多使用QuEChERS，检测器为气相色谱-串联质谱仪或超高效液相色谱-串联质谱仪[5-7]。本文参考相关研究的结论，结合禽肉基质特性，优化出适用于禽肉基质中氟吡菌酰胺的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

氟吡菌酰胺标准品(纯度99.9 %，北京曼哈格生物科技有限公司)；乙酸乙酯、乙腈、正己烷、甲酸(色谱纯，上海安谱科技股份有限公司)；超纯水(自制)；无水硫酸钠(分析纯，国药)；N-丙基乙二胺吸附剂(PSA)(粒径范围：40 μm～60 μm，平均孔径：100 Å，上海安谱科技股份有限公司)；十八烷基键合硅胶吸附剂(C18)(粒径范围：40 μm～60 μm，平均孔径：60 Å，上海安谱科技股份有限公司)。

1.2 仪器与设备

超高效液相色谱-串联质谱仪(型号I Class/5500，配有ESI源，美国沃特世公司/AB SCIEX)；气相色谱串联质谱仪(型号8890/7000D，配有EI源，美国安捷伦公司)；高速冷冻离心机(型号HR21M，湖南赫西仪器装备有限公司)；电子天平(型号ME204，梅特勒托利多科技(中国)有限公司)；超声机(型号SB25-12D，宁波新芝生物科技股份有限公司)；氮吹仪(型号Xce/Vap，美国Horizon公司)；涡旋振荡器(型号Multi reax，德国HEIDOLPH公司)。

1.3 试验方法

1.3.1检测器的选择

将GC-MS/MS和LC-MS/MS的仪器参数调试到最佳响应状态，将浓度为1.0 ng/mL的氟吡菌酰胺标准溶液上机，比较两种检测器的信噪比与精密度，选择相同浓度条件下信噪比大且响应值稳定的检测器。

1.3.1.1GC-MS/MS仪器条件

色谱柱：DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样方式：不分流进样；载气(氦气)流速：1.0 mL/min；进样量：1.0 μL；升温程序见表1；进样口温度：280 ℃，传输管温度：280 ℃。监测方式：MRM；氟吡菌酰胺特征离子：173/145(定量离子)，173/95(定性离子)。

表1 气相色谱仪升温程序

1.3.1.2LC-MS/MS仪器条件

色谱柱：BEHC18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；柱温：40 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液(A)、乙腈(B)；洗脱方式：梯度洗脱，见表2；离子源：电喷雾离子源ESI+；离子化电压：5000 V；去溶剂温度：550 ℃；喷雾气：50 psi；辅助加热气：50 psi；气帘气：20 psi；监测方式：MRM；氟吡菌酰胺特征离子：397/173(定量离子)，397/208(定性离子)，进样体积：2.0 μL。

表2 梯度洗脱比例

1.3.2标准曲线的选择

因禽肉基质复杂，在电离过程中目标物易受杂质干扰，导致离子化效率或高或低。为验证基质效应的影响，实验准备了4种禽肉基质曲线与溶剂配制的曲线上机检测，观察其基质效应。具体方法为：溶剂曲线：用乙腈将氟吡菌酰胺稀释成浓度为0.5 ng/mL，1.0 ng/mL，5.0 ng/mL，10 ng/mL，20 ng/mL和50 ng/mL的系列工作曲线；基质曲线：分别移取一定体积的标准溶液至空白基质提取液中，45 ℃水浴氮气吹近干，加入乙腈1.0 mL，涡旋复溶，配制成和溶剂曲线一致的浓度上机测试。

1.3.3提取溶剂的选择

按照氟吡菌酰胺的物理性质，其在水中溶解度较低，易溶于有机溶剂。实验分别采用乙腈、1%甲酸乙腈和乙酸乙酯为提取溶剂，比较3种溶剂的提取效率。具体步骤：称取4种禽肉试样(鸡肉、鸽肉、鸭肉和鹅肉)各2 g(精确至0.001 g)，置于50 mL离心管中，分别加入10 mL提取溶剂和5 g无水硫酸钠，振荡5 min后超声10 min，以8 000 r/min离心10 min，取出上清液，残渣加入10 mL提取溶剂再次提取，合并提取液于45 ℃水浴氮吹近干，加入2.0 mL乙腈溶解，3.0 mL乙腈饱和正己烷去脂，离心，去除正己烷，取乙腈层过0.22 μm滤膜上机检测。

1.3.4净化方法的选择

国内外农药残留主要净化方法有：SPE、GPC和QuEChERS，净化试剂：无水硫酸钠、石墨化碳黑(GCB)、氨基(NH2)、PSA、弗罗里硅土和C18等。本文研究对象为禽肉，试验用QuEChERS方法净化，根据禽肉的特性，选择无水硫酸钠、PSA和C18为净化剂。其中无水硫酸钠能去除水份；PSA用于消除各种有机酸、脂肪酸、糖类和部分色素的影响；C18可吸附油脂和非极性杂质。本实验将考察PSA、C18的用量与回收率的关系。

2 结果与讨论

2.1 检测器的选择、曲线范围和检出限

将氟吡菌酰胺配制为1.0 ng/mL，在GC-MS/MS和LC-MS/MS上测试10次，由软件计算得到的信噪比的平均值以及相对标准偏差数据见表3。

表3 GC-MS/MS和LC-MS/MS不同浓度下信噪比

以上数据可知，同一浓度下LC-MS/MS上的信噪比比GC-MS/MS上的信噪比大且相对标准偏差较小，因此LC-MS/MS上的灵敏度和精密度优于GC-MS/MS。故后续实验选择LC-MS/MS进行测试。

实验发现当氟吡菌酰胺浓度在0.5 ng/mL时，LC-MS/MS上的信噪比和精密度满足实验要求，结合基质效应的影响，以0.5 ng/mL为基质曲线的最低点浓度。当氟吡菌酰胺浓度高于50 ng/mL时，在LC-MS/MS上的响应过载，线性相关系数不能满足要求。因此线性范围定为：0.5 ng/mL ～50 ng/mL，相关系数在0.99以上。取阴性基质提取液重复进样20次，计算出噪声的标准偏差Sb，按公式CL仪器=3×Sb/b(b：标准曲线斜率)，得出仪器的检出限。用仪器的检出限除以称样量，乘以稀释倍数，综合考虑基质效应，最终确定LOD(检出限)为0.5 μg/kg。

图1 氟吡菌酰胺标准溶液的质谱图(浓度：0.5 ng/mL)

2.2 标准曲线的选择

基质效应与基质的种类有关，农药结构、浓度以及检测器及进样方式也会对基质效应产生影响[8]，通常表现为使目标物质信号降低或增强。用基质标准曲线的斜率除以溶剂标准曲线的斜率来表示基质效应(Me)的大小。具体公式如下。

当Me为负值时表示存在基质抑制效应，Me为正值时表示存在基质增强效应；绝对值越大则基质效应越强，如恰好为0则表示不存在基质效应[9]。实验采用4种阴性禽肉基质(鸡肉、鸽肉、鸭肉和鹅肉)配制成基质标准曲线和乙腈配制的溶剂标准曲线上机测试，其相关系数、斜率和Me值见表4。

表4 不同溶剂配制的标准曲线方程及斜率、相关系数和Me

从Me值得知，禽肉中存在一定的基质效应，且4种禽肉之间的斜率较为接近，即基质干扰较为相似。由此得出，禽肉中含有相似杂质对氟吡菌酰胺的离子化效率产生干扰，对其响应产生抑制作用。故后续实验选择空白基质标准曲线作为定量依据。

2.3 提取溶剂的选择

实验用鸡肉、鸽肉、鸭肉和鹅肉在1.0 μg/kg 、2.0 μg/kg 、5.0 μg/kg浓度处加标，分别用乙腈、乙酸乙酯和1%甲酸乙腈提取，每个浓度做6平行，计算出平均回收率，其数据见图2-图5。

图2 鸡肉基质中3种提取溶剂的回收率

图3 鸽肉基质中3种提取溶剂的回收率

图4 鸭肉基质中3种提取溶剂的回收率

图5 鹅肉基质中3种提取溶剂的回收率

由上图可得，1%甲酸乙腈在4种禽肉基质中的平均回收率均高于乙腈和乙酸乙酯提取的回收率。故提取溶剂选用 1%甲酸乙腈。

2.4 净化方式的选择

通过加标回收实验(加标浓度：10 μg/kg)，在C18粉末用量为100 mg的条件下，测试加入不同质量的PSA粉末(0 mg、25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg和200 mg)对4种禽肉基质的净化效果，观察回收率的变化。实验数据见图6。

图6 PSA不同用量的回收率

图6表明 ，PSA的用量在0 mg ～125 mg时回收率均为增长趋势，当用量在125 mg ～200 mg时回收率无明显增长。为节省成本，将PSA用量定为125 mg。

在PSA粉末用量为125 mg的条件下，测试用不同质量的C18粉末(0 mg、25 mg、50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg、175 mg和200 mg)对4种禽肉基质净化效果，比较其回收率。实验数据见图7。

图7 C18不同用量的回收率

图7可得 ，C18用量在0 mg ～150 mg时回收率均为增长趋势，但C18用量在150 mg ～200 mg时回收率程下降趋势。C18用量为150 mg时回收率最佳。

2.5 检测方法的验证

试验结果表明：用1%甲酸乙腈提取，使用125 mg PSA以及150 mgC18净化，LC-MS/MS检测为禽肉中氟吡菌酰胺最佳检测方法。通过加标回收对该方法进行验证，结果如表4所示。

表4 方法优化后测得的氟吡菌酰胺的回收率和相对标准偏差(n=6)

使用最佳前处理方法得到的回收率范围在87.5%～96.4%之间，相对标准偏差2.5%～7.7%，能够满足日常农药残留检测的需求。

3 结论

本文建立了1%甲酸乙腈提取、QuEChERS净化、高效液相色谱-串联质谱测定禽肉中氟吡菌酰胺残留量的检测方法。采用MRM模式扫描，基质标准曲线外标法定量。考察了线性范围、基质效应，确定了检出限，验证了回收率与精密度，各项参数均符合实验室检测要求。本文对动物源性食品中氟吡菌酰胺检测的研究起到积极的作用。