不同霉菌培养基对Rhinocladiella sp.的影响及其生长水平预估的比较性研究

朱 旼 上海工微所科技有限公司，上海 200233

霉菌在自然条件下广泛存在于陆地环境中，至今已发现超过45 000种[1]。作为其次级代谢产物，霉菌毒素一旦形成即可能存在于真菌菌落的所有部位，包括菌丝、子实体和孢子内，或是被分泌到所寄生的基质表面或内部，对基质造成污染[2]。经世界粮农组织估算，在全世界范围内约有25%的农作物遭受霉菌污染并产生霉菌毒素，造成的经济损失可达数十亿美元[2]。因此，霉菌已被认定为造成食物短缺的第二大因素，仅次于虫害[2]。

农作物及其加工产品在遭受霉菌污染后，不仅会引发外观以及品质上的劣化，用含有霉菌毒素的饲料喂养家禽家畜会造成的动物脏器损害或流产[3, 4]，严重的甚至会引发幼崽死亡，具有极强的致癌致畸以及致突变作用[1]。另外，由于霉菌毒素的化学稳定性很强，产生污染后非常难以从粮食或饲料中去除，并会持续在后续的农产品加工过程中造成污染[5]。通过富集作用积蓄在饲喂动物体内的霉菌毒素会因此残留在畜产品内部，并在被人类食用后，因其具有的肾毒性和肝毒性引发人体病变，损害健康[1]。

本实验经由对客户送检的变性淀粉样品中发现的一种特异生长的未知霉菌A所进行的分离、纯化、鉴定和验证，对其性状进行了详细研究，并根据其在3种常用霉菌检测培养基上的生长差异，及其在5种霉菌培养基上的淀粉样品加菌试验结果，试图寻找一种最适用于该菌株的早期检出、并能对其生长趋势进行预估的培养基。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

实验所使用的仪器包括Zealway GI100TR型高压灭菌锅，齐欣LRH-250型恒温培养箱，精宏XMTD-8222型水浴锅，北京东联哈尔BSC01 360IIA2型超净工作台等。

实验使用的孟加拉红琼脂(HB0237-2)、沙氏琼脂培养基(HB0235-10)、马铃薯葡萄糖琼脂(HB0233)等培养基均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。

1.2 菌株分离与纯化

本次使用的实验菌株分离自客户送检的变性淀粉样品。采取对三批间隔送样的非重复淀粉样本的分离与纯化，同时使用3种不同的培养基进行平板培养，并对所培养的平板内菌落进行比较、分离、纯化和确证，最终获得性状稳定的纯化目标菌株。

1.2.1菌株分离

将3个不同批次含目标未知霉菌A的淀粉样品按照国标[6]中的培养温度，在参考了不同的霉菌检测标准后，选择使用孟加拉红琼脂(RBA)[6]、沙氏琼脂培养基(SDA)[7, 8]和马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)[6, 8]3种培养基，按每个梯度平行2组、每种培养基3个梯度(10-1-10-3)倾倒平皿培养14 d，对比各培养基中菌落形态后，选择培养至第10 d，生长在10-2梯度的RBA平皿上性状稳定的典型菌落，作为纯化使用的分离菌株A’。

1.2.2菌株纯化

挑取该分离菌株A’，接种在RBA平皿上并连续转接培养三代。当观测到的菌落性状稳定且无其他杂菌伴生后，即得到未知霉菌A的初代纯化菌株A0。

1.2.3确证试验

由于纯化菌株A0在3种不同培养基上均出现两种不同形态的菌落，故对这两种菌落进行确证试验，将其分别按照对方优势的生长条件进行培养，观测菌落形态，验证其是否为不同菌株。

1.3 菌种鉴定

本次菌种鉴定委托北京六合华大基因科技有限公司对纯化菌株A0进行检测。将测序结果(表1)进行NCBI-BLAST比对后可得该未知纯化菌株A0为Rhinocladiellasp. 137/143/155x214wat (以下简称Rhinocladiellasp.)。

表1 引物信息

1.4 试验方法

1.4.1菌悬液的制备

向灭菌后的2 mL离心管中加入1 mL无菌生理盐水。选择新鲜培养的Rhinocladiellasp.纯化单菌落一个(直径1 cm左右)，用1 μL孔径的一次性接种环无菌刮取菌落表面孢子2次，将刮取的孢子转移至离心管的生理盐水中，用1 mL的一次性移液管反复轻柔吹打离心管中的孢子悬液制成初始孢子匀液。将该初始孢子匀液按照10倍的稀释度配置10-1～10-5梯度的接种用稀释菌悬液。

1.4.2纯化Rhinocladiellasp.生长试验

按照该菌悬液梯度，每个梯度接种2块无菌平皿，每块使用1 mL菌悬液进行接种。每组10-1～10-5梯度的平皿分别使用RBA、SDA或PDA中的一种，于28 ℃±1 ℃进行培养，并对培养结果进行计数。

1.4.3确证试验

分别挑取两种形态不同的菌落并按1.4.1步骤分别制备菌悬液。对于生长在培养基表面的菌落直接刮取其孢子部分，底部生长的菌落则将菌落带培养基整个挑出并在盛有1 mL生理盐水的离心管中捣碎，将离心管于6 000 r/min离心5 min后吸取上清液备用。

先取2块空白平皿，每块选择一种菌悬液接种1 mL后，倾倒RBA并轻轻晃匀。另取2块空白平皿，先倾倒RBA后静置凝固，再于琼脂表面各选择其中1种菌悬液接种1 mL并微微倾斜，使菌悬液均匀覆盖整个琼脂平面。将2组平皿于28 ℃±1 ℃进行培养。

1.4.4加淀粉样品的生长试验

取适量1.1中的RBA和PDA，按照生产商提供的配方表中的有效成分数据，参考SDA培养基配方表中葡萄糖与蛋白胨含量进行补全，配制与1.1的SDA配方中葡萄糖与蛋白胨含量一致的改良RBA(RBA改)与改良PDA(PDA改)培养基(表2)。

将按照1.4.1方法制备的1 mL纯化Rhinocladiellasp.菌悬液用9 mL无菌生理盐水稀释10倍后，加入10 g无菌淀粉样品中并充分混匀。等淀粉干粉完全吸收10 mL菌悬液后，加入90 mL无菌生理盐水，充分混匀，制成Rhinocladiellasp.-淀粉-生理盐水悬浊液。以此悬浊液为10-1稀释度，使用无菌生理盐水配制5组10-1～10-5梯度的样品试液，以每个梯度2块平行平皿进行接种，每组分别使用表2中的1种培养基于28 ℃±1 ℃同时培养。

表2 培养基成分表(单位：g/L)

2 结果

2.1 淀粉样品中未知霉菌A的性状

在使用淀粉样品研究未知霉菌A的生长曲线时，发现在杂菌干扰下其肉眼可辨的早期生长从接种后第4 d开始。接种后的第5 d～6 d菌落生长会进入平台期，期间会小幅增长。6 d后菌落生长主要以增加表面积为主，在数量上不再有明显增长。

1～3: 为同一块平板在接种后第3 d～5 d的变化，箭头所指的圈中心黑点为同一菌落; 4: 为Rhinocladiella sp.在淀粉样品中受到其他杂菌干扰下生长至第5 d的情况。1: 培养第3 d； 2: 培养第4 d； 3: 培养第5 d图1 Rhinocladiella sp.在沙氏琼脂培养基上的 形态变化(3 d～5 d)

2.2 纯化Rhinocladiella sp.的生长实验与方差分析

2.2.1纯化Rhinocladiellasp.的性状

纯化Rhinocladiellasp. 的菌落生长缓慢且不扩散生长，在SDA和PDA琼脂表面生长的部分表现为由深色边缘所包围的浅灰色圆形菌落，而在RBA表面生长的部分为深色边缘与浅灰色中层所包围的灰色中心圆形菌落(图2)。

1：在RBA表面为深色边缘、浅灰色中层、中心为深灰色的圆形菌落；2：在SDA表面表现为深色边缘浅灰色中心的圆形菌落；3：在PDA表面亦表现为深色边缘浅灰色中心的圆形菌落。

分别使用RBA、SDA和PDA对纯化Rhinocladiellasp.进行培养时，在不同培养基及不同稀释度的平皿内均发现两种不同形态的目标菌，一种是紧贴平皿底部生长，从平皿底部可观测到其中心部位有一深色核状部分的浅色半透明圆形菌落；另一种是生长在平皿内的琼脂表面，菌落形态为深灰至黑色天鹅绒样边缘光滑的圆形菌落。图3为PDA培养基上培养至第7 d的纯化Rhinocladiellasp.，外周浅色、中心有一深色核区的菌落为其生长在平皿底部的厌氧型，均一深灰色的圆形菌落为生长在培养基表面的好氧型。

图3 纯化Rhinocladiella sp.在PDA培养 基上的形态(7 d)

采用确证试验将原本生长在底部的浅色菌落接种至琼脂表面后，菌落形态与接种在琼脂表面、原先即为表面生长的深色菌落表现一致；同时，原先为表面生长的深色菌落，在被接种到平皿底部后也表现出了与原先紧贴平皿底部生长的菌落一致的形态：具有深色内核与浅色外周。

经确证试验检验后可得，此2种不同形态菌落实为纯化Rhinocladiellasp.生长的不同表型。生长于平皿内琼脂表面的为其好氧型，紧贴平皿底部生长的为其厌氧型。在对厌氧平板进行长期培养(>10 d)后发现，在菌落体积增加到一定大小后，其顶部也会突破培养基表面生长并表现出好氧型的菌落形态，形成上半部钻透琼脂表面生长在平面以上、下半部继续在琼脂内部生长的形态(图4)。

图4 穿透SDA培养基上表面生长的 厌氧型Rhinocladiella sp.

2.2.23种培养基的比较试验

纯化Rhinocladiellasp.在RBA、SDA和PDA中的生长均从接种后第2 d起可被观测到，并在第3 d进入生长对数期，第5 d进入平台期。同时使用3种培养基对纯化Rhinocladiellasp.进行培养，以5 d为一个周期，重复培养5个周期后，对每种培养基在每个菌悬液梯度下单日所得的菌落数均值进行比较，培养基间差异见图5。

图中数据为纯化Rhinocladiella sp.5日培养的菌落计数日均值图5 纯化Rhinocladiella sp.在3种培养基上的 生长表现

2.2.3单因素方差分析

对培养第3 d纯化Rhinocladiellasp.在3种培养基上的5组菌落计数平均值使用Excel进行单因素方差分析[9]，结果如表3。

表3 纯化Rhinocladiella sp.在3种培养基上培养 第3 d所得菌落数的单因素方差分析

用同样方法，对培养第5 d纯化Rhinocladiellasp.在3种培养基上的5组菌落计数平均值进行单因素方差分析，结果如表4。

表4 纯化Rhinocladiella sp.在3种培养基上培养 第5 d所得菌落数的单因素方差分析

2.3 含淀粉样品的加菌试验与方差分析

2.3.1加菌试验的5种培养基比较

使用RBA、RBA改、SDA、PDA和PDA改5种培养基按1.4.4方法进行培养，4 d为一个周期的试验，共进行3轮试验。对每种培养基在每个菌悬液梯度下单日所得的菌落数均值进行比较，各组试验中第2 d、3 d、4 d平皿上的菌落数变化情况见图6，每2 d之间的菌落数增量均值见图7。

图中数据为4 d培养的菌落计数日均值图6 5种培养基在含淀粉样品的Rhinocladiella sp.加菌试验中的表现

2.3.2单因素方差分析

对3轮试验中，5种培养基分别培养3 d后得到的3组菌落计数平均值进行单因素方差分析，结果如表5。

去掉PDA组的数据后，对剩下的RBA、RBA改、SDA、PDA改4组数据再重复一次方差分析，所得结果如表6。

图中数据为第2 d～第3 d与第3 d～第4 d培养的 菌落计数增量均值图7 5种培养基上生长的Rhinocladiella sp. 菌落数增量

表5 5种培养基在加菌试验的第3 d所得 菌落数的单因素方差分析

表6 4种培养基在加菌试验的第3 d所得菌落 数的单因素方差分析

3 分析与探讨

作为全世界最大的小麦生产国和世界第二大玉米生产国，我国的玉米淀粉产量连年高居淀粉行业榜首。随着中原地区的淀粉加工企业扩大生产规模，2018年我国小麦淀粉产量也突飞猛进，市场占比跃居行业第二[10]。在各类淀粉总产量中，淀粉深加工产品已连续8年占比超过50%，深加工产品中变性淀粉产量仅次于淀粉糖，位列第二[11]。然而作为我国淀粉行业最主要的两种原料，玉米和小麦却一直饱受霉菌毒素的侵扰。

对于已知的近400种霉菌毒素进行研究后发现其主要为环肽、多鲸酸类、萜烯类和含氮代谢产物[2]，而通过谷物对粮食及饲料等农产品造成影响的霉菌毒素，则主要是由曲霉菌属、青霉菌属、麦角菌属和镰刀菌属所产生[12]，其中呕吐毒素与玉米赤霉烯酮为近年来我国污染小麦和玉米等最普遍、毒性危害最严重的霉菌毒素[3, 13]。

Rhinocladiellasp.此前从未作为农作物及其加工产品中的污染源被报道，此次在多种变性淀粉样品中持续(>6个月)广泛地存在，说明其与农产品加工业有着一定程度的关联。

Rhinocladiellasp.作为一种生长缓慢的子囊菌纲丝分孢子真菌，因其生长特性，学界对其现有的研究较少，国内尚无对其生长特性的详细研究。该菌种的野外发现多来自于热带及亚热带的林木、植物根部及落叶上，如曾诗涵[14]曾在相思树样木、樟树样木和白匏子样木的树种上发现其入侵；以及VICENTE V A等人[15]则在马缨丹和银桦木上发现过该霉菌。其对人类活动的影响多为经由皮肤入侵而引发的皮肤、脏器感染及住院患者的系统性血液感染等，如GOMES R R等人[16]的研究曾发现其为着色真菌病的诱因之一；NUCCI M[17]等人的研究也显示了其与多发性骨髓瘤以及艾滋病之间的关联。

在对人类生产与生活产生的价值方面，Rhinocladiellasp.的作用仍知之甚少。曾有少量研究如KOSHIMURA M[18]等人发现其对萜类溴化物存在生物转化的作用；彭程和杨中铎的研究[19]则显示其分离的化合物中部分具有中等强度的单胺氧化酶抑制活性；另外WAGENAAR[20]等人则发现该菌种能通过生物活性分离能产生3种新松胞菌素(cytochalasin),对多种人肿瘤细胞有很强的抑制作用。

胡翔颖[21]等人曾在对与其同属的Rhinocladiellamackenziei进行研究时，发现一种来自该菌株的蛋白RmZHD具有良好的玉米赤霉烯酮水解活性和热稳定性，亦将该属与霉菌毒素关联在一起。随着本次对Rhinocladiellasp.性状的初步研究，该属霉菌与淀粉加工行业的相关性可得到进一步揭示。

由于本次实验所用菌株须先从客户提供的淀粉样品中进行分离，而样品中混杂大量其他霉菌和酵母，再加上该未知菌株生长缓慢，在低稀释度组别中经常发生被其他真菌侵占生长空间的情况，造成目标菌被其他真菌覆盖、抑或是将目标菌误认为培养基沉淀(如PDA中的未溶解淀粉颗粒)，从而造成计数时的误读。因此在菌株分离时，使用十倍梯度稀释方法将杂菌密度降低，使得早期生长阶段的目标菌能有足够空间和营养形成菌落。

纯化后的Rhinocladiellasp.生长速度比其在淀粉样品中受到大量杂菌干扰时略快。因无杂菌干扰的环境能极大提高其在菌落形成初期的观测机会，使用3种不同培养基对Rhinocladiellasp.的早期观测报告均从接种后第4 d提早到了第2 d。菌落生长在培养第3 d进入对数期，菌落数量呈几何级增长，并在第5 d进入平台期。因5 d后菌落数量增长没有显著变化，故将培养基生长对比的观测周期定为接种后培养第2～5 d。

在经过5轮5 d培养后，对比每日各梯度不同培养基中Rhinocladiellasp.菌落的算数平均数，发现两组培养基数据与同日其他两种培养基数据产生明显差异。其一为培养第3 d的SDA平皿组，其菌落数量的算数平均值高出该日其他两种培养基组别将近一倍；另一组为培养第5 d的RBA，与其他2组培养基之间的平均值差也达到了3～4×104CFU/mL。

为了确认培养基成分是否对实验结果有显著影响，将此2 d的5轮菌落计数分别进行单因素方差分析。由分析结果的p值可得，培养第3 d的组间p=0.042<0.05，故该组数据中SDA的培养效果明显区别于RBA和PDA，目标菌在SDA培养基上有显著增殖效应；培养第5 d的组间p=0.82>0.05，故在培养第5 d时三种培养基的培养效果并无显著差异。

在确定SDA对纯化Rhinocladiellasp.具有快速增值和早期预估作用之后，对比3种市售培养基配方，发现其主要成分在葡萄糖和蛋白胨的用量上具有较大差异。遂将纯化生长试验中表现欠佳的2种培养基：RBA与PDA的配方，按照市售SDA配方进行添补，配置成两种改良培养基：改良RBA与改良PDA，但保留它们原先含有的孟加拉红、氯霉素和马铃薯浸粉等成分，然后按照纯化生长试验方法，对无菌淀粉样品中接种纯化Rhinocladiellasp.进行培养基对比试验。

在培养至第3 d时，SDA、RBA和RBA改3种培养基上生长的菌落数量基本处于同一水平，改良PDA培养基与之略有差距，而市售PDA上生长的菌落数量最少。

对第3 d数据进行2次单因素方差分析之后发现，尽管PDA改的数据在图中与SDA、RBA和RBA改3种培养基数据相差较大，但方差分析结果显示这4种培养基在培养3 d的菌落数量都处于相似水平，没有显著差异(p=0.13>0.05)，只有市售PDA培养基所生长的菌落数量与其余4种培养基有显著差异(p=0.01<0.05)。

观察培养第2～4 d间每天的菌落数增长情况可以发现，尽管淀粉样品的存在对Rhinocladiellasp.的生长有一定影响，使得SDA的早期快速增殖优势变弱，但进入对数生长期第1 d的SDA中Rhinocladiellasp.菌落数增量仍居5种培养基之首，并且对数生长期第2 d的增量为所有培养基中最低值，再次证明SDA在有淀粉样品的情况下，依然能有相对出色的前期增殖与目标菌含量预估作用，可在培养第3 d就使样品中的Rhinocladiellasp.菌落数量迅速接近原先培养4 d才可到达的平台期附近。再加上其琼脂形态颜色清澈透明无杂质，对纯化Rhinocladiellasp.的浓度预估和早期发现均有显著优势，从而能够帮助客户最高效地分析产品霉菌污染的原因，改善工艺，保障产品质量安全。