固相萃取-高效液相色谱法测定奶糖中7种合成着色剂的含量

张楠楠 上海工微所科技有限公司，上海 200233

食品着色剂是为食品着色的一类食品添加剂，分为天然着色剂和合成着色剂。合成着色剂由于色泽鲜艳，易着色，成本较低，稳定性好，在食品加工过程中被广泛使用。然而长期过量摄入到人体，可能会导致慢性中毒，更有甚致畸致癌等风险[1]。因此，我国GB 2760—2014《食品添加剂使用标准》[2]中对不同食品中各种合成着色剂的使用和限量做出了明确规定。

目前测定合成着色剂的方法也比较多，如高效液相色谱法[3,4]、超高效液相色谱法[5]、液相色谱-串联质谱法[6]等，高效液相色谱法是较为普遍的检测手段，且对实验室设备要求相对较低。GB 5009.35—2016[7]和SN/T 1743—2006[8]中高效液相色谱法测定食品中合成着色剂的方法，是采用聚酰胺粉吸附法进行提取，但在实际操作过程中，由于过程繁琐，损耗严重，影响实验结果的准确性和检测效率[9]。固相萃取法是目前常用的一种提取方法，能够对样品中的色素进行净化和富集，并能最大程度的降低杂质对结果的影响，具有方便快速、重复性好等优点被广泛应用[10]。

本文通过沉淀剂沉淀奶糖样品中的蛋白质、脂肪和明胶等物质，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液提取，混合弱阴离子交换小柱净化，高效液相色谱法多波长检测奶糖中的柠檬黄、日落黄、新红、胭脂红、苋菜红、诱惑红和亮蓝这7种合成着色剂的含量，灵敏度高，准确，简单，实用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：奶糖，市售。

7种合成着色剂：柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝和诱惑红标准品(1 000 μg/mL，北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司)；氨水、甲酸、硫酸锌、亚铁氰化钾、乙酸锌(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；甲醇、乙腈(色谱纯，DIKMA)；乙酸铵(色谱纯，MACKLIN)，实验室用水均为一级水。

1.2 仪器与设备

Thermo Scientific U3000高效液相色谱仪(DAD-3000二极管阵列检测器，赛默飞世尔科技公司)；超声波清洗器(KQ-100，昆山市超声仪器有限公司)；固相萃取仪(Supelco SPE)；CNW poly-sery PWAX弱阴离子交换SPE小柱(150 mg/6 mL，北京迪马科技公司)；防腐氮吹仪(EFTT-DC12，上海安谱实验科技股份有限公司)；电子天平(MS204TS，梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；离心机(TDL-5A，上海安亭科学仪器厂)。

1.3 实验方法

1.3.1标准曲线的配制

准确吸取200 μL柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝和诱惑红标准品于10 mL容量瓶中，加水溶解配制成20.0 μg/mL的储备液，再逐级稀释至0.02 μg/mL、0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL和5.00 μg/mL。

1.3.2仪器条件

色谱柱：SunShell C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；

保护柱：SunShell Guard Cartridge Column RP；

流动相：A:甲醇；B：0.02 mol/L乙酸铵；

流速：1.0 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：10.0 μL；

检测器：二极管阵列检测器；

检测波长：400 nm，529 nm，630 nm。

梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.3.3样品前处理

称取2 g(精确至0.000 1 g)样品于离心管中，加5 mL温水溶解，5 mL硫酸锌溶液(120 g/L)，10 mL甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液，用氨水调节pH至8.0～9.0，震荡均匀，超声30 min，4 500 r/min离心5 min，收集上清液，重复提取3次，合并上清液。用甲酸调节上述溶液pH至6.0，待净化。PWAX弱阴离子交换小柱使用前先用5 mL甲醇和5 mL水活化小柱，取10.0 mL待净化液上样，用5 mL水淋洗小柱并吹干，最后用5 mL10%的氨化甲醇洗脱，收集洗脱液。洗脱液于50 ℃水浴并氮吹至近干，用甲醇∶0.02 mol/L乙酸铵溶液(1∶1，v/v)定容至1.0 mL，混匀，经0.45 μm水相滤膜过滤上机。

2 结果与讨论

2.1 HPLC检测色谱图

国家标准GB 5009.35—2016[7]和SN/T 1743—2006[8]选择254 nm作为检测波长，由于该波长是折中选取了各色素都有吸收的一个共用波长，既不是各色素的最大吸收波长，又不是干扰少、稳定性好的最佳检测波长[11,12]，因此在此波长下可能会导致某些色素化学吸收有干扰，灵敏度较低。为了使7种合成着色剂均有较好的灵敏度，本文采用二级阵列检测器全波长(200 nm～900 nm)对7种合成着色剂进行全波长扫描，根据各合成着色剂的吸收光谱图确定柠檬黄和日落黄的最佳检测波长为400 nm，苋菜红、胭脂红、新红和诱惑红的检测波长为529 nm，亮蓝的检测波长为630 nm。由图1可知，在相应的检测波长下，7种合成着色剂的背景干扰小，响应值高。

A：400 nm；B：529 nm；C：630 nm图1 合成着色剂标准品色谱图

2.2 前处理优化

2.2.1沉淀剂的选择

奶糖中主要的干扰物质有蛋白质、脂肪和明胶等，如果不除去这些干扰物，则试样液较浑浊，不利于固相萃取柱的净化。通过试验分别采用硫酸-钨酸钠溶液、乙酸锌-亚铁氰化钾溶液、三氯乙酸-乙腈溶液、硫酸锌-氢氧化钠溶液、硫酸锌-氨水溶液这几个沉淀体系沉淀蛋白。实验结果表明，硫酸-钨酸钠溶液和三氯乙酸-乙腈溶液无法有效沉淀，离心后上清液仍然混浊，无法进行下一步固相萃取净化。由于部分色素在较酸或较碱条件下，颜色易发生变化，因此在硫酸锌溶液作用下沉淀，氢氧化钠溶液调节样液pH，会影响提取效果。乙酸锌-亚铁氰化钾和硫酸锌-氨水溶液作为沉淀剂对7种合成着色剂的提取效果的影响见表2。由表2可知，乙酸锌-亚铁氰化钾沉淀体系的回收率偏低，可能是由于部分合成着色剂与蛋白共同被沉淀分离，致回收率偏低，并且乙酸锌-亚铁氰化钾自身的颜色使被测溶液颜色发生变化产生干扰，达不到检测目的。硫酸锌-氨水溶液能有效的沉淀蛋白质和脂肪，得到较好的回收率，因此本文选择该沉淀体系。

表2 不同沉淀剂对合成着色剂回收率(%)的影响

2.2.2提取液的选择

将奶糖加水溶解后，加5 mL硫酸锌溶液沉淀，氨水调节pH后，加入不同的提取液进行合成着色剂的测定。经查阅文献[13-17]，本文选择用水∶10%氨水溶液(9∶1)、甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1)、乙醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1)、甲醇∶乙腈∶水∶10%氨水溶液(5∶3∶1∶1)、乙醇∶乙腈∶水∶10%氨水溶液(5∶3∶1∶1)、甲醇∶乙醇∶乙腈∶10%氨水溶液(3∶3∶3∶1)这六种不同的提取液进行比较，以上比例都为体积比，结果见表3。

由表3可知，通过比较上述六种提取液提取效果，发现甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)的提取效果最好，既能保证色素的萃取效果，又能降低蛋白质等干扰物在提取液中的溶解程度，更有利于固相萃取的净化。此外，使用提取液萃取样品中的色素时，提取次数越多，会导致上清液越浑浊，越不利于固相萃取。因此，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)提取液重复提取三次，即能把奶糖中的合成着色剂提取完全，也能保证提取液较快较好的净化。

表3 不同提取液对合成着色剂回收率(%)的影响

2.3 线性范围和检出限

由表4可知，在0.02 μg/mL～20.00 μg/mL的线性范围内，7种合成着色剂具有较好的线性关系，线性相关系数r≥0.999 96。以3倍信噪比(S/N=3)计算检出限，7种合成着色剂的检出限见表4。

表4 7种合成着色剂保留时间、线性方程、 相关系数及检出限

2.4 加标回收率

选择原味奶糖样品进行加标回收率实验，分别添加3个水平混合标准溶液，每个水平做6个平行，采用硫酸锌-氨水溶液沉淀，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液提取，PWAX小柱净化，上机测定，计算得出加标回收率和相对标准偏差如表5所示。加标浓度为0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg时，该方法7种合成着色剂的回收率为82.9%～99.2%，相对标准偏差为0.36%～2.78%，能满足检测要求。

表5 奶糖中7种合成着色剂的平均回收率和 相对标准偏差(n=6)

2.5 样品检测情况

在市场上购买不同口味的奶糖，采用1.3.3实验方法，检测其样品中的合成着色剂含量，结果如表6所示。结果表明，在这些样品中，不同口味的奶糖中均检出合成着色剂，但均未超出标准GB 2760—2014[2]中规定的最大使用限量。

表6 不同口味奶糖合成着色剂检测情况

3 结论

本试验建立了一种简便、高效的，可同时测定奶糖中7种合成着色剂含量的方法。通过比较不同沉淀剂的沉淀效果，以及不同提取液对样品中合成着色剂的提取效果，选择硫酸锌-氨水溶液沉淀蛋白，甲醇∶水∶10%氨水溶液(7∶2∶1，v/v)溶液提取，采用弱阴离子交换固相萃取小柱对样品中的合成着色剂进行净化富集，7种合成着色剂实现了良好的分离。同时利用二极管阵列检测器多波长分析功能，提高目标物的响应值，降低了样品中基质的干扰，从而获得更低的检出限和更好的精密度。7种合成着色剂在0.02 μg/mL～20.00 μg/mL的浓度范围内线性良好，相关系数r均大于0.999 96，方法检出限为0.03 mg/kg。加标水平在0.5 mg/kg、1.0 mg/kg、2.0 mg/kg时，平均回收率在82.9%～99.2%之间，相对标准偏差小于2.8%，并且能满足实际样品分析的需要。该方法简便、快速、准确，适合于奶糖样品中多种合成着色剂的同时测定。针对其他基质较为复杂的样品，也可参考该方法开展检测。