一种Zalerion arboricola发酵产物的分离、纯化和结构鉴定

张 磊， 吕坚方， 邵 东， 徐作武， 王小平 浙江医药股份有限公司新昌制药厂，浙江 新昌 312500

自从第一个抗真菌药两性霉素B问世以来，人类与真菌感染类疾病的斗争已经持续了半个多世纪。按照国际医学界的通行标准，真菌感染可分为浅表性真菌感染、皮下真菌感染和系统性真菌感染。其中系统性真菌感染(即深部真菌感染)最具致命性。在预防和治疗浅表性真菌感染方面，现代临床医学已取得突破。但对于皮下及深部真菌感染，因真菌抗药性及现有药物的毒副作用等原因，尚未取得显著进展。近年来，随着广谱抗生素、免疫抑制剂和抗恶性肿瘤药物的广泛应用，开放性治疗手段如器官移植、插管技术及外科介入治疗的深入开展，增加了深部真菌感染的发病机率。条件致病性真菌所引发的系统性真菌病日益增多，如患者不能获得及时治疗，往往会病情加重甚至危机生命。[1]

临床上治疗真菌感染使用的药物主要有两性霉素B和唑类抗真菌药物(如氟康唑、伊曲康唑和伏力康唑等)，但这些药物在安全性和抗菌谱等方面均存在一些问题，因此临床上亟待开发高效、低毒的新型广谱抗真菌药物。在大量试验的基础上，研究人员找到了对治疗真菌感染有显著疗效的棘白菌素类化合物。该类化合物可抑制真菌细胞壁的β-1,3-D-葡聚糖的合成，破坏细胞壁完整性，从而发挥杀菌作用。因哺乳动物细胞无细胞壁，故该类化合物对哺乳动物细胞并无影响。进一步临床研究表明，该类化合物与两性霉素B和唑类抗真菌药物无交叉耐药性，对人体的毒性低，临床效果较好。其中以芬净类化合物为代表已上市多年[2]。

卡泊芬净是以微生物发酵产物纽莫康定B0为中间体经化学合成而得。在更广泛的相似类化合物筛选过程中，研究人员又发现该类化合物的其他多种类似物。这些类似物均以乙酰六环为基本结构，通过结合不同取代基，从而导致分子的抗真菌活性及代谢性质等方面表现出一定程度的差异[3]。

在从微生物发酵产物中筛选具有抗真菌活性化合物的过程中，除了对菌体的主要代谢产物进行研究外，还应对代谢过程中产生的其他多种化合物进行考察。在从菌体代谢产物中成功分离得到单一化合物后，再对这些化合物进行抗菌活性考察。也可以对所获得的化合物进行结构修饰，然后再进行抗菌活性的筛选。这样就有可能筛选得到药效更好、不良反应更少的新活性化合物[4]。Zalerionarboricola菌体在发酵过程中除通过次级代谢可以产生纽莫康定B0之外，也会产生多种其他的结构类似物[5]。目前国内外研究主要集中在纽莫康定B0发酵工艺优化以及发酵液中纽莫康定B0的提取纯化[6-9]，对发酵过程中所产生的其他结构类似物的分离纯化则鲜有报道。本文从Zalerionarboricola发酵液中分离到一个纽莫康定B0的结构类似物并进行了结构鉴定。以该化合物为基础进行结构修饰后，就可以进一步确定修饰物的抗真菌效果[10]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株

ZalerionarboricolaHCCB30111保存于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.5412。

1.1.2培养基

斜面培养基PDA(%)：葡萄糖 25，蛋白胨 0.9，琼脂 2.0。

种子培养基(%)：葡萄糖 2.5，KH2PO40.9，酵母粉 0.5，泡敌 1.0，85%乳酸 0.2 mL，微量元素 0.1 mL，pH 6.0；

发酵培养基(%)：蔗糖 12.5，谷氨酸钠 0.8，酵母粉 0.8，脯氨酸 1.5，KH2PO40.15，七水合硫酸镁 0.04，泡敌 1.0，微量元素 1 mL，MES缓冲盐 1.5，pH 5.3；

微量元素组成(g/L)：七水硫酸亚铁 1.0，一水硫酸锰 0.2，二水氯化钙 0.1，硼酸 0.056，二水氯化铜 0.025，四水钼酸铵 0.019，12N盐酸 50 mL。

1.1.3主要仪器

制备型液相色谱仪DAC 50(江苏汉邦科技有限公司)，1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，6520 Q-TOF液质联用系统(美国Agilent公司)，核磁共振波谱仪DMX400(德国布鲁克公司)，旋转蒸发仪YRE-201D(巩义予华仪器公司，中国)，实验型冻干机FD-80(北京博医康科技有限公司)。X3色谱填料(10 μm,大连化学物理研究所)；C18色谱填料(10 μm，苏州纳微科技有限公司)。XAD-1180N大孔吸附树脂(陶氏化学公司，美国)。

1.1.4试剂

乙醇(分析纯)购自安徽安特食品股份有限公司。丙酮(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司。乙腈(分析纯)购自星可化学科技(上海)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1高效液相色谱法(HPLC)检测条件

色谱柱：Phenomenex kinetex C18 (2.6 μm,1.7 mm×150 mm)；流动相：乙腈∶水=40∶60；流速：0.8 mL/min；检测波长：220 nm；柱温：35 ℃。

1.2.2质谱检测条件

直接进样模式，电喷雾电离源(ESI)正离子检测，裂解电压135 V，离子源温度230 ℃，气体流速：8.0 L/min,样品浓度1 mg/mL。

1.2.3核磁共振检测条件

测试条件为CD3OD；观察频率100 MHz，扫描范围-20 ppm～220 ppm。采样时间0.68 s，延迟时间2 s，扫描次数5 120次，测定温度300 K。

1.2.4纽莫康定B0(Pneumocandin B0)发酵液的制备

斜面培养条件：28 ℃，5 d；种子培养条件：挖块接种，25 ℃，220 r/min ，3 d；发酵条件：转种量10%，25 ℃，220 r/min，发酵培养7 d。

1.2.5固液分离及粗品的制备

纽莫康定B0发酵液为实验室自制[11]。发酵液30 L用陶瓷膜过滤浓缩至15 L；第一次萃取在浓缩液中加入15 L乙醇，在陶瓷膜循环罐循环30 min后用陶瓷膜过滤至约10 L；第二次萃取再次加入20 L 50%乙醇-水溶液，在陶瓷膜循环罐循环30 min后用陶瓷膜过滤至约10 L；第三次萃取再次加入20 L 50%乙醇-水溶液，在陶瓷膜循环罐循环30 min后用陶瓷膜过滤至约10 L结束操作。每次萃取滤液都用大孔吸附树脂(树脂柱体积200 mL)吸附萃取液中目标产物。

吸附后的树脂柱用40%乙醇预洗，洗下色素类杂质及其它吸附不牢的杂质；再用70%乙醇解析，分段收集解析液。利用液相检测后，合并含高浓度目标产物的解析液，然后加入1倍体积的活性炭脱色。过滤除去活性炭后，脱色液45 ℃减压浓缩除乙醇，得到含有目标组份的固液混合物，冻干后得到粗品。

1.2.6目标化合物的富集

目标化合物的富集使用DAC 50制备柱(装入X3色谱填料约500 mL)进行。粗品溶解于85%丙酮-水溶液中(浓度为每毫升液体溶解0.1 g粗品)，制备时每次进样体积 50 mL，流动相为丙酮∶水=85∶15，进样后可以根据在线图谱监测组份层析情况，目标组分出现色谱吸收峰后分段收集，收集完成后结束本次制备分离，进行第二次制备，重复进样-分段收集操作，直至积累足够的样品。每次制备的分段收集液用HPLC检测，合并纯度≥75%的部分作为有效层析液，45 ℃减压浓缩除丙酮后进入下一步。

1.2.7纯化

使用装C18色谱填料(约500 mL)的DAC 50制备柱进行纯化。上一步得到的料液，按照体积加入60%的乙腈，全部溶解后作为本步料液。制备时每次进样体积25 mL，流动相为乙腈∶水=65∶35，进样后可以根据在线图谱监测组份层析情况，目标组分出现色谱吸收峰后分段收集，收集完成后结束本次制备分离，进行第二次制备，重复进样-分段收集的的操作，直至积累足够的样品。每次制备的分段收集液用HPLC检测，合并纯度≥95%的部分作为有效层析液，45 ℃减压浓缩除乙腈后，进行后处理。

1.2.8后处理

纯化后的合格收集液，45 ℃减压浓缩除去乙腈后进行冻干，得到目标化合物样品。

2 结果与分析

2.1 目标化合物的高分辨质谱数据

对目标化合物进行质谱检测，条件为电离源(ESI)正离子模式。对目标化合物的主要信号峰进行分析，结果如图1和表1所示。目标化合物的准分子离子峰[M+H]+为1 065.580 9，元素组成为C50H81N8O17；1 047.566 7峰为目标化合物脱去OH基团的信号峰；1 065.581 2、1 067.566 4为目标化合物准分子离子的同位素信号峰。

图1 目标化合物的高分辨质谱图

表1 目标化合物的高分辨质谱检测数据

2.2 目标化合物的核磁共振谱数据

对目标化合物进行核磁共振检测，测试条件为CD3OD。所得核磁检测谱图包括：图2(目标化合物核磁共振检测1H谱)；图3(目标化合物的核磁共振检测13C谱)；图4(目标化合物的核磁共振检测COSY谱)；图5(目标化合物的核磁共振检测HMBC谱)；目标化合物核磁共振检测的1H和13C-NMR数据汇总见表2。

2.3 目标化合物结构解析

按照样品的结构，残基可分为3-OHPro、OHGln、DiOHTyr、4-OHPro、Thr、DiOHPro和DMM七个部分。对核磁相关谱图(图2和图3)进行分析表明：该化合物有4个甲基、16个亚甲基(其中2个连N原子，分别为3-OHPro 中的C-5和4-OHPro中的C-5)、 16个是次甲基(7个氧代，6个氮代，1个氧氮二元代)、 1个二取代的苯环、8个羰基碳。1H、13C-NMR数据(表1)和二维相关光谱表明该化合物是一个pneumocandin A0类似物，具有2个羟基脯氨酸(3-OHPro和4-OHPro)、1个二羟基酪氨酸类似物(DiOHTyr)、1个羟基谷氨酰胺(OHGln)、1个苏氨酸(Thr)、一个二羟基脯氨酸(DiOHPro)和1个二甲基肉豆蔻酸。通过COSY和HMBC相关谱(图4和图5)，连接得到了该化合物的平面结构。

表2 目标化合物的核磁共振检测1H和13C-NMR数据汇总

图2 目标化合物核磁共振检测1H谱图

图3 目标化合物核磁共振检测13C谱图

COSY谱(图4)显示化合物有下列5个自旋偶合相关体系：3-OHPro: 2-CH→3-CH→4-CH2→5-CH2；OHGln: 2-CH→3-CH→4-CH2；DiOHTyr: 2-CH→3-CH→4-CH和2’/6’-CH→3’/5’-CH；4-OHPro: 2-CH→3-CH2→4-CH→5-CH2；Thr: 2-CH→3-CH→4-CH3；DiOHPro: 2-CH→3-CH2→4-CH→5-CH；DMM: 2-CH2→3-CH2→4-CH2→5-CH2→6-CH2→7-CH2→8-CH2→9-CH2→10-CH→11-CH2→12-CH→13-CH2→14-CH3。【备注：此段组织成合适的阅读结构】

图4 目标化合物核磁共振检测COSY谱图

1H-13C-NMR远程偶合相关谱(图5)表明：3-OHPro中2-H和5-H2与OHGln中的1-C相关，表明OHGln通过酰胺键与3-OHPro相连；OHGln中2-H与DiOHTyr中的1-C相关，表明DiOHTyr通过酰胺键与OHGln相连；DiOHTyr中2-H与4-OHPro中的1-C相关，表明4-OHPro通过酰胺键与DiOHTyr相连；4-OHPro中2-H和5-H2与Thr中的1-C相关，表明Thr通过酰胺键与4-OHPro相连；Thr中2-H与DiOHPro中的1-C相关，表明DiOHPro通过酰胺键与Thr相连；DiOHPro中2-H与DMM中的1-C相关，表明DMM通过酰胺键与DiOHPro相连。

图5 目标化合物核磁共振检测HMBC谱图

通过COSY和HMBC的二维相关，把各基团相连，得到化合物的完整结构，如图6所示：

图6 纽莫康定6b的分子结构

3 结论与讨论

本文以Zalerionarboricola菌体发酵液为原料，依次通过陶瓷膜固液分离，大孔树脂吸附目标产物，解析后活性炭脱色，减压浓缩除去溶剂后冻干得到粗品。粗品溶解后，用X3色谱填料进行目标化合物的层析富集，含量合格的层析液进行减压浓缩，得到富集后的目标化合物样品。再次溶解后，用C18色谱填料进行目标化合物的层析纯化，含量合格的层析液进行减压浓缩，冻干后得到目标化合物样品。最后通过高分辨质谱、核磁共振检测对目标化合物进行结构鉴定。通过对鉴定时得到的1H和13C-NMR数据进行分析汇总，并和文献报道的1H和13C-NMR数据进行比对，两者信息一致；再通过COSY和HMBC的二维相关，把各基团相连，得到化合物的完整结构，也和文献报道的结构一致，可以确认该化合物为纽莫康定6b。[12]

制备得到目标化合物后，有多方面的实际意义。首先，以该化合物的含量作为一个检测指标，可以优化发酵工艺参数，控制发酵产物中纽莫康定6b的比例，从而降低随后的纯化工艺的难度，提高生产效率，降低生产成本，为大规模工业化生产提供技术支持；其次，在纽莫康定6b的基础上，可以进行化学合成，通过结构修饰，连接不同取代基团后在进行生物活性的筛选，有可能得到潜在的抗菌活性更好的化合物。