高通量测序研究浓香型酒醅的细菌菌群多样性及共变性

陈慧颖， 李慧星， 许 彬， 曹 斌， 王春艳,3 1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030； .南阳理工学院河南省工业微生物资源与发酵技术重点实验室，河南 南阳 473004； 3.南阳理工学院生物与化学工程学院，河南 南阳 473004

白酒是我国传统的蒸馏酒，酒醅中微生物的组成及其变化规律对白酒品质具有重要影响[1]。酒醅细菌在白酒生产中起着关键作用，一是参与白酒生产主要代谢途径；二是增加白酒风味；三是丰富白酒活性成分[2,3]。然而与酒曲和窖泥相比，酒醅细菌菌群的相关研究仍然较少[3]。

高通量测序技术可以快速分析复杂体系的微生物菌群，且提供全面准确的菌群信息[4,5]，已被应用于不同香型白酒酒醅的细菌菌群研究[6-12]。ZOU等[6]指出泸型白酒酒醅中芽孢杆菌属Bacillus和乳杆菌属Lactobacillus是优势菌属。Jing[7]等基于高通量测序分析两个品牌酱香型酒醅的细菌多样性，变形杆菌门Proteobacteria和厚壁菌门Firmicutes的相对丰度高，乳杆菌属Lactobacillus和假单胞菌属Pseudomonas的相当丰度随着发酵时间延长不断增加。邢敏钰等[8]采用高通量测序分析芝麻香型酒醅的乳酸菌菌群，发现了5个属的乳酸菌，它们分别是魏斯氏菌属Weissella、片球菌属Pediococcus、乳杆菌属Lactobacillus、明串珠菌属Leuconostoc和乳球菌属Lactococcus。

浓香型是中国白酒的重要香型之一，占市场份额70%以上[13,14]。浓香型酒醅的微生物菌群是学者们的研究热点[15-29]。SUN等[27]采用高通量测序分析浓香型酒醅的细菌多样性，结果表明醋杆菌属Acetobacter和乳杆菌属Lactobacillus为丰度最高的物种，与冬季酒醅相比，夏季酒醅的乳杆菌属Lactobacillus丰度增加，醋酸杆菌属Acetobacter丰度降低。翟磊等[28]采用高通量技术研究发现宜宾产区浓香型酒醅中细菌主要以片球菌属Pediococcus、乳杆菌属Lactobacillus和瘤胃球菌属Ruminococcus为主，其中片球菌和乳杆菌为主的乳酸菌是发酵中后期的优势细菌。高江婧[25]等研究发现浓香型酒醅整个发酵过程中，随着发酵时间的延长，乳杆菌科Lactobacillaceae和肠杆菌科Enterobacteriaceae的相对丰度降低，瘤胃菌科Ruminococcaceae和梭菌科Clostridiaceae微生物的相对丰度增加。胡晓龙[29]等采用高通量测序技术分析了贾湖酒醅微生物群落，发现乳杆菌属Lactobacillus是发酵中、后期酒醅中的绝对优势微生物，同时间节点下各层酒醅的微生物聚类没有明显规律。不同香型白酒酒醅的细菌菌群有差异性，相同香型不同来源的白酒酒醅的细菌菌群同样存在差异。然而，当前研究多集中于某个酒厂酒醅发酵过程的功能细菌[20-24]、细菌菌群多样性及其与风味物质的关联[25-29]，而对酒醅细菌菌群的共性变化规律研究较少。实验取样于河南三个不同浓香型白酒厂的酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)，采用的Illumina MiSeq高通量测序技术分别研究入窖酒醅和出窖酒醅的细菌菌群，依次在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)和属(genus)5个水平上进行分析，一方面展示河南浓香型白酒入窖酒醅和出窖酒醅的细菌微生物多样性；另一方面，分析三个不同酒厂的酒醅发酵后细菌菌群的共性变化规律，为深度探究白酒酒醅的细菌菌群提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要材料

浓香型酒醅(入窖酒醅和出窖酒醅)样品分别取自于河南南阳社旗、濮阳南乐和周口鹿邑的三个白酒厂[30]，入窖酒醅分别命名为EFG-1，EFG-2，EFG-3；出窖酒醅分别命名为OFG-1，OFG-2，OFG-3。

1.2 实验方法

实验方法和数据分析参考文献[5]。PCR所用的引物已经融合了Miseq测序平台的V3-V4通用引物。341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG (barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG；805R引物GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTA CHVGGGTATCTAATCC。

2 结果与分析

2.1 测序序列数目和多样性指数分析

浓香型酒醅样品经高通量测序和质量控制后，获得有效序列。根据差异水平在0.03(即相似度97%)的水平上聚类得到操作分类单元(OTU)。由表1可以看出：样品测序的覆盖率均大于95%，表明测序结果代表样品的真实情况。三个入窖酒醅样品(EFG-1、EFG-2和EFG-3)的有效序列数量分别是34 219、45 593和32 362，聚类得到OTU数目分别为5 681、7 684和4 221；三个出窖酒醅样品(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的有效序列数量分别是31 978、33 265和40 932，聚类得到OTU数目分别为3 792、3 091和1 811。在序列聚类获得OTU的基础上，分别采用Shannon指数和Chao1指数描述菌群物种的多样性，其中Shannon指数和Chao1指数越大，说明群落多样性越高。EFG-1、EFG-2和EFG-3的Shannon指数和Chao1指数均大于OFG-1、OFG-2和OFG-3的Shannon指数和Chao1指数，说明入窖酒醅的细菌菌群多样性高于出窖酒醅的细菌菌群多样性。浓香型酒醅经过发酵后细菌菌群的物种多样性降低。这是由于浓香型酒醅发酵是在厌氧条件下的产酶、产酸、产酒精等复杂过程，入窖酒醅的细菌微生物在发酵过程中不断衰亡后分解[29]。

表1 OTU数量及多样性指数

实验依次在门(phylum)、纲(class)、目(order)、科(family)和属(genus)5个分类水平上进行分析，通过酒醅样品的细菌菌群分布和变化趋势来阐释酒醅中细菌菌群的多样性和共变性。为了使细菌菌群分布的显示效果较好，实验选取相对丰度较大的前15个物种，将相对丰度较低的部分合并为Other显示在图上。细菌菌群变化趋势是在细菌菌群分布的基础上，将三个入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和三个出窖酒醅样品(OFG-1、OFG-2和OFG-3)分别进行比较，分析出三个不同来源浓香型酒醅发酵后具有相同和显著变化趋势的细菌物种。

2.2 在门(Phylum)水平上浓香型酒醅的细菌菌群

图1为在门(Phylum)水平上浓香型酒醅的细菌菌群，可以看出：入窖酒醅(EFG-1、EFG-2和EFG-3)和出窖酒醅(OFG-1、OFG-2和OFG-3)的优势菌群均是厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、异常球菌-栖热菌门Deinococcus-Thermus，它们的相对丰度分别为8.86%～90.3%、7.38%～63.34%、0.08%～16.2%、2.04%～9.96%和0.13%～4.99%。分别比较入窖酒醅和出窖酒醅的细菌菌群分布，图2显示了出窖酒醅中厚壁菌门Firmicutes的相对丰度均高于入窖酒醅中厚壁菌门Firmicutes的相对丰度，而变形菌门Proteobacteria和放线菌门Actinobacteria的相对丰度降低。

图1 在门水平上浓香型酒醅的细菌菌群

图2 在门水平上浓香型酒醅中细菌变化趋势

2.3 在纲(Class)水平上浓香型酒醅的细菌菌群

在纲(Class)水平上浓香型酒醅的细菌菌群如图3所示，入窖酒醅和出窖酒醅的优势菌群有杆菌纲Bacilli、梭菌纲Clostridia，放线菌纲Actinobacteria、α-变形菌纲Alphaproteobacteria、β-变形菌纲Betaproteobacteria和γ-变形菌纲Gammaproteobacteria，它们的相对丰度分别是7.48%～69.24%、1.2%～19.89%、0.78%～17.68%、0.12%～29.7%、0.88%～4.71%和0.48%～28.88%。分别比较入窖酒醅和出窖酒醅的细菌菌群分布，图4显示了在纲水平上浓香型酒醅中细菌的变化趋势。酒醅发酵后，杆菌纲Bacilli、梭菌纲Clostridia的相对丰度均有增加，而放线菌纲Actinobacteria、α-变形菌纲Alphaproteobacteria和γ-变形菌纲Gammaproteobacteria的相对丰度明显降低。

图3 在纲水平上浓香型酒醅的细菌菌群

2.4 在目(Order)水平上浓香型酒醅的细菌菌群

在目(Order)水平上浓香型酒醅的细菌菌群如图5所示，入窖酒醅和出窖酒醅的优势菌群是乳杆菌目Lactobacillales、芽孢杆菌目Bacillales、梭菌目Bacillales、肠杆菌目Enterobacteriales、根瘤菌目Rhizobiales、微球菌目Micrococcales，它们的相对丰度分别为5.27%～62.24%、1.92%～32.59%、1.19%～19.85%、0.73%～14.78%、0.54%～13.15%和0.18%～17.09%。分别比较入窖酒醅和出窖酒醅的细菌菌群分布，图6显示了在目水平上浓香型酒醅的细菌变化趋势，酒醅发酵后乳杆菌目Lactobacillales、梭菌目Bacillales的相对丰度增加，而肠杆菌目Enterobacteriales、根瘤菌目Rhizobiales、微球菌目Mi-crococcales和伯克氏菌目Burkholderiales的相对丰度降低。

图5 在目水平上浓香型酒醅的细菌菌群

图6 在目水平上浓香型酒醅中细菌变化趋势

2.5 在科(Family)水平上分析浓香型酒醅的细菌菌群

在科(Family)水平上浓香型酒醅的细菌菌群如图7所示，入窖酒醅和出窖酒醅的优势菌群是乳杆菌科Lactobacillaceae、芽孢杆菌科Bacillaceae、高温放线菌科Thermoactinomycetaceae、梭菌科Clostridiaceae、肠杆菌科Enterobacteriaceae和葡萄球菌科Staphylococcaceae，它们的相对丰度分别为2.62%～76.77%、0.07%～13.77%、0.02%～18.81%、0.31%～15.78%和0.73%～14.78% 和0.01%～8.22%。分别比较入窖酒醅和出窖酒醅的细菌菌群分布，图8显示了在科水平上浓香型酒醅的细菌变化趋势，酒醅发酵后乳杆菌科Lactobacillaceae、梭菌科Clostridiaceae的相对丰度增加，而肠杆菌科Enterobacteriaceae、微球菌科Micrococcaceae的相对丰度降低。

图7 在科水平上浓香型酒醅的细菌菌群

2.6 在属(Genus)水平上分析浓香型酒醅的细菌菌群

在属(Genus)水平上浓香型酒醅的细菌菌群如图9所示，入窖酒醅和出窖酒醅的优势菌有乳杆菌属Lactobacillus、肠杆菌属Enterobacter、短波单胞菌属Brevundimonas、克罗彭施泰特氏菌Kroppenstedtia、节杆菌属Arthrobacter、糖多孢菌Saccharopolyspora、葡萄球菌属Staphylococcus，它们的相对丰度分别为1.38%～75.99%、0.15%～12.51%、0.11%～2.78%、0.02%～17.02%、0.05%～14.88%、0.03%～8.37%、0.01%～8.21%。分别比较入窖酒醅和出窖酒醅的细菌菌群分布，图10显示了在目水平上浓香型酒醅的细菌变化趋势，酒醅发酵后乳杆菌属Lactobacillus的相对丰度增加，肠杆菌属Enterobacter、短波单胞菌属Brevundimonas的相对丰度降低。

图9 在属水平上浓香型酒醅的细菌菌群

图10 在属水平上浓香型酒醅中细菌变化趋势

3 结论

基于Illumina MiSeq高通量测序展示了河南浓香型酒醅的细菌微生物多样性，入窖酒醅的细菌微生物多样性高于出窖酒醅的细菌微生物多样性。入窖酒醅和出窖酒醅的在门水平上的优势菌有厚壁菌门Firmicutes、变形菌门Proteobacteria、放线菌门Actinobacteria、拟杆菌门Bacteroidetes、异常球菌-栖热菌门Deinococcus-Thermus；在属水平上的优势菌有乳杆菌属Lactobacillus、肠杆菌属Enterobacter、短波单胞菌属Brevundimonas、克罗彭施泰特氏菌属Kroppenstedtia、节杆菌属Arthrobacter、糖多孢菌属Saccharopolyspora、葡萄球菌属Staphylococcus。在浓香型酒醅的细菌微生物多样分析基础上，通过分别比较三个不同酒厂的入窖酒醅和出窖酒醅的细菌菌群，可知浓香型酒醅发酵后细菌菌群的显著共性变化规律(图11)：厚壁菌门、杆菌纲、乳杆菌目、乳杆菌科、乳杆菌属的相对丰度增加；变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、肠杆菌属的相对丰度降低。酒醅的细菌菌群在门、纲、目、科、属5个分类水平上逐次分析，细菌物种变化规律无法完全可循，如根瘤菌目、伯克氏菌目、梭菌科、微球菌科的相对丰度变化在属水平上没有分析得到对应的细菌物种，这是由于分类水平越高，种类越多，相对丰度较低的物种变化趋势逐渐不明显；另一方面，随着分类水平的提高，样品中出现了未分类和未定地位的细菌。

图11 浓香型酒醅发酵后细菌菌群的变化规律