液体曲制酒精研究的回顾

胡学智 上海市工业微生物研究所， 上海 200233

酒精是重要的有机化工原料，也是一种重要的燃料。液体曲制酒精是酒精工业的重大革新，也是新中国成立后我国发酵工业的一项重大科研项目，它的研究成功，首次把抗生素生产的深层培养技术引进到我国的发酵行业，为酒精发酵生产的机械化自动化打下了基础，也为我国的氨基酸、柠檬酸、酶制剂等新型发酵产业的建立奠定了基础。作者有幸亲历该项目的研究，深感有责任将该研究的来龙去脉作一记叙，为我国发酵工业提供点滴史实。

1956年春，我由上海卫生食料厂(即后来的上海酵母厂)调到市食品工业公司技术科工作，分管发酵行业。当时上海的发酵行业规模很小，只有上海酒精厂、华星酒精厂、华光啤酒厂、上海啤酒厂和上海酵母厂五家，而众多的酱油厂与酒厂，除了益民酿造厂外，都不属于市食品工业公司所管。当时我的工作是收集和审核各厂的生产日报表以及组织行业协作组各种生产活动。

某日，科长梁石民同志取出一份材料要我阅办和提出意见，这是时任市第一轻工业局试验室、上海酒精厂、华星酒精厂、屈臣氏汽水厂四家单位的顾问陈騊声先生写的一份关于开展液体曲制酒精研究的立题申请报告。关于液体曲我略知一二，也颇感兴趣。所谓液体曲在美国称为“深层培养糖化酶”(submerged culture of glucoamylase)，在日本叫作“液曲”即“液体曲”(Liquid koji)，是采用生产抗生素同样的方法，在发酵罐中通气搅拌培养而成的富含淀粉酶的霉菌培养物。以往在以甘薯、玉米和木薯等淀粉原料发酵生产酒精时，经蒸煮过的料醪必须先用曲子(麸曲)或麦芽(二者均含淀粉酶)将淀粉的一部份转化成还原糖后，才可用酵母发酵成酒精，麸曲的质量直接影响到酒精的收率。制曲是一个劳动强度非常大的工艺过程。以日产酒精7吨的某厂为例来说，每天需投入2000多kg麸皮，用20多名强壮工人来制曲，使用5000多个木盘来盛曲培养，培养麸曲的曲室占地300 m2～500 m2，既闷热又潮湿，像个硕大的蒸笼，工人在内劳动操作条件恶劣且甚易感冒，亟需改进。若使用液体曲来代替麸曲，则生产可以机械化、自动化，人力成本与劳动强度可大大降低，此项技术1948年首先由UNDERKOFLER博士发明并用于酒精生产，日本也在上世纪50年代初在富金源孝教授领导下研究完成并用于生产。为此我就去局试验室和酒精厂进一步了解和调查研究，深感此项研究意义之重大和必要性，乃积极争取局领导的支持，终获批准立项，并呈报食品工业部。是年食品工业部召开的全国食品科研计划会议将液体曲研究列为全国重点项目之一，由市一轻局试验室为负责单位，中科院微生物研究所、食品工业部上海科学研究所(即现轻工业部食品发酵研究院)、食品工业部制酒局、华南工学院共同成立试点委员会开展工作。我也因此调入市第一轻工局试验室工作。虽有多家单位参加液体曲试点委员会，但食品工业部上海科学研究所只派了一位同志来市一轻局实验室参加试验，华南工学院则由余蔚英教授另行组织团队自行研究,其他单位只是挂名而已。

去试验室报到时，液体曲研究才开始，参加研究工作的是两位学化工合成的同志，因不熟悉发酵业务，工作开展比较困难，只有我是发酵专业的毕业生(1953年下学期曾在有“中国抗生素工业摇篮”之称的上海第三制药厂毕业实习了半年多，在童村厂长、蔡聿彪总工、许文思和余尔谷等专家的指导下学习，故对抗生素发酵有关技术比较熟悉)，于是仿照第三制药厂的一套办法，置备起摇床、灭菌室等设备，碰到困难则请教第三制药厂的专家，工作终于逐步开展起来。

不久食品工业部上海科学研究所派了张饧清同志来参加工作(她是南京工学院1957年发酵专业毕业生，是我的师妹)，梁天锡(是我复旦大学农业化学系农产品加工组1953年毕业的师兄)、张家锐(解放前在前实业部工业试验所工作，与陈騊声先生曾共事)都先后到来。梁、张与我三人在陈先生领导下分三个组分头负责菌种、培养基筛选与车间中间试验。试验室还办起了技术培训班，从社会上吸收一批高中毕业生来学习以充实试验室各课题组的人员，人员增加了，科研进度也大大提高。其时日本农艺化学代表团来华学术交流，在北京作了糖化酶与液体曲的研制等精彩的报告，来上海时又专程来我室访问和座谈，使我们获益不少。上世纪50年代国人对淀粉酶的认识还非常模糊，以为曲霉的淀粉酶即是麦芽所含的β-淀粉酶，曲霉糖化力用生成的麦芽糖量来表示，直到1957年8月日本农艺化学代表团富金源孝、饭塚广教授来华作学术交流，作了“糖化发酵的酶化学研究”、“用液体曲制造酒精的概要”等学术报告，加上中国科学院微生物研究所张树政教授发表了“霉菌的淀粉酶”的综述论文，对国外有关霉菌淀粉酶的研究作了详细的介绍，才使大家对霉菌淀粉酶有了一个较全面的认识，这些知识对我们的研究工作有着莫大启发和指导意义。

我们对由国内收集的曲霉和中科院上海植物生理研究所焦瑞身先生赠送的黑曲霉NRRL 330与黑曲霉NRRL 337开展了试验，对酒精厂先前使用的产黄绿色孢子的米曲霉NO.7同黑曲霉NRRL 330等经酸、热处理作了对比，建立了适合于菌种与培养基筛选大量样品测定的方法。在上海酒精厂合作下，通过90多批200 L发酵罐的扩大试验，发现供试的6株曲霉(甘薯曲霉,黑曲霉NO.2,黑曲霉NRRL 330,黑曲霉NRRL 337,米曲霉NO.7)中以黑曲霉NRRL 330、黑曲霉NO.2为最佳，向蒸煮醪添加10%～15%的液体曲便可完全代替6%的麸曲来生产酒精(据报道国外液体曲用量在10%～20%)，美国生产液体曲的菌种是黑曲酶NRRL 337，日本使用的菌种是泡盛曲霉，这说明了当时我国的液体曲研究起点并不低。

1957年底在上海酒精厂对NRRL 330用2 000 L培养基作了液体曲扩大培养试验(结合实验室用三角瓶进行酒精发酵试验)，也表明使用10%液体曲大型发酵罐培养的液体曲糖化，其酒精发酵的淀粉利用率与使用麸曲糖化者相当，均在90%左右。以上试验也表明了我国酒精厂使用的糖化用菌种并不乏优良菌株。

由于当时我国对科研成果还未建立成果鉴定与验收制度，一些科研信息大多是通过行业内交流或从刊物报导上获取而被采用的。60年代以后，随着市场的需要，不少研究和生产单位对糖化酶生产菌积极进行人工诱变，先后获得了一批糖化酶活力较高的菌种，如沪轻2号、东酒1号、M 85、UV-06、NCN 24等等，每毫升液体曲糖化淀粉转化成葡萄糖的能力由M 85的3 g逐渐提高到3917-2的10 g、黑曲霉165的20 g。液体曲的研究也演变成糖化酶的研究，其测定酶活力的内容就只偏重于糖化力一项了。

1980年以后，国家实行了改革开放，国际学术交流也日趋频繁。以中国科学院微生物研究所获得黑曲霉突变株UV-11为契机，使糖化酶活力转化淀粉成葡萄糖的能力一举提高到70 g，每毫升发酵液的酶活力达6 000单位以上。随着研究的进一步深入，上世纪末糖化酶活力已达10 000单位以上，与当年液体曲NRRL330只有数百单位比较已不可同日而语。可以这样说，我国液体曲的研究为以后糖化酶研究的开展创造了有利条件。根据回忆,当年在液体曲项目研究中可总结出以下几点：改进了糖化酶活力的测定方法，使之适合于菌种筛选、培养基筛选等大量样品的酶活力测定；对国内所用糖化酶生产菌的酶活力进行了筛查，得知国内酿酒厂和酒精厂所使用的菌种中也不乏糖化酶活力高的菌株；通过实践对黑曲霉NRRL 330，米曲霉NO.7的淀粉酶酶系和酒精发酵的关系有了进一步的了解；以及培养基和培养条件对黑曲霉NRRL 330产淀粉酶及酒精产率的影响等，有助于酶的利用。

1 改进了糖化酶活力的测定方法

在中国科学院微生物研究所以及国内酿酒厂和酒精厂的支持下收集到了一批菌种，包括上述中科院上海植物生理研究所焦瑞身先生慷慨赠送给我们研究的糖化酶生产菌黑曲霉NRRL 330与NRRL 337。当时国内酒精厂和酿酒厂还没有建立起一个评估酒曲优劣的方法，或仅凭经验来判断，少数酒精厂则使用了国外应用多年的Lintener林奈法来测定酶活力，操作繁琐、准确度差，不适于需大量样品测定的筛选菌种或培养基的工作。而文献发表的其他一些方法，大多是在三角瓶中添加底物和淀粉酶，同样都很麻烦而不适于大量样品糖化酶活力的测定。针对三角瓶体积大、在水浴中测定样品数量有限且容易侧翻的缺点，笔者将底物与酶的反应改为置于大号试管中进行，一个试管架可容纳40支试管，对20个样品可同时反应，而生成的还原糖则改用Willstater的碘法测定，避免了铜试剂之需置于火上加热的操作。为了检验碘量法的可靠性，笔者曾对山芋、玉米、麸皮、米糠等原料分别用酸水解法或先用淀粉酶抽提其中淀粉，再用酸水解将其转化成还原糖后，分别用Lane-Eynon法、标准葡萄糖液反滴定法、Bertrand法以及碘定量法进行了比较(见表1)。结果表明,碘量法适用于山芋、玉米、大米等纤维素含量和杂质含量低的原料的直接酸水解物中还原糖量之测定，而不适用于麸皮米糠等杂质多的样品水解液中还原糖量之测定，即使先用α-淀粉酶抽提其淀粉成为糊精，再酸水解的样品中还原糖之测定，结果也会偏高而不适用，但对于酶活测定时所用底物是纯淀粉，液体曲培养基中即使有少量粗原料残余，对碘量法也不致造成明显的影响，且因碘量法中使用淀粉溶液作指示剂，滴定终点明析，精确性高，酒精发酵得率与酶活力基本一致(见表2)。我们以pH 4.6、40 ℃反应1 h，生成1 mg麦芽糖(当时认为糖化酶水解淀粉生成的还原糖是麦芽糖)为一个酶单位。这一小小改进却成为日后糖化酶研究的有力工具。

表1 用不同方法测定淀粉原料水解物还原糖

表2 液体曲淀粉酶系中几种酶对酒精发酵的影响

此法在上海酒精厂使用后，林奈法逐步被淘汰。通过行业交流,碘量法被酒精行业广泛采用，也被编入了轻工业部高等教材《工业发酵分析》一书(轻工出版社,1979)。80年代以后，一些合资企业、外资企业其糖化酶产品活力纷纷采用各自制定的方法测定，以致产品之间无从比较。但笔者认为我们采用的方法还是比较可靠，方便实用。此法经发酵协会验证并稍作改进后呈报国家标准局,被列为糖化酶国定测定方法。

2 糖化酶生产菌酶活力的筛选及黑曲霉NRRL 330与米曲霉NO.7淀粉酶系性质之比较

我们对收集的若干黑曲霉及其他曲霉中的8株进行了糖化与酒精发酵试验，结果表明以NRRL 330的糖化酶活力为最强，但在我国酒精厂中所使用的菌种中如甘薯曲霉、黑曲霉NO.2等其糖化酶活力并不逊于NRRL 330。试验表明,影响酒精发酵得率的酶主要是糖化酶和麦芽糖酶，而α-淀粉酶活力的大小与酒精得率无直接关联(表2)。

为了了解酸、热对麦芽淀粉酶的影响，1953年OHLSSON将麦芽淀粉酶在pH 7.0，70 ℃处理15 min后发现可将麦芽β-淀粉酶完全破坏而保留α-淀粉酶，将麦芽淀粉酶在0 ℃，pH 3.3下处理15 min则α-淀粉酶被破坏而保留β-淀粉酶，说明了β-淀粉酶的耐酸性较强而α-淀粉酶则耐热性较强，日本北原觉雄也利用酸、热处理的方法来观察对黑曲霉与米曲霉的淀粉酶之影响，指出黑曲霉的α-淀粉酶耐酸性较米曲霉强，而糖化酶耐热性也比米曲霉强。为了研究所使用的菌种黑曲霉NRRL 330与米曲霉 NO.7的性质与之有何不同，我们将两株曲霉的液体曲分别在pH 1.0～8.0，40 ℃～60 ℃不同条件下处理14 min～60 min，来观察不同pH与温度下对糖化酶、麦芽糖酶与α-淀粉酶的影响。结果表明，黑曲霉的糖化酶和麦芽糖酶耐酸性较强，在最适pH范围3.0～5.0间之最适温度为60 ℃，在pH 7.0、60 ℃处理15 min，两种酶的活力损失也甚微，此与北原觉雄的结论不同；而米曲霉NO.7则相反，pH 4.5、60 ℃处理1 h失活后达80%以上，pH 2.5处理30 min则两种酶活力丧失殆尽，但在pH 7.0、55 ℃处理15 min则大部分酶活力可以保存。

试验表明,黑曲霉NRRL 330的α-淀粉酶与麦芽糖酶与米曲霉的不同，经pH 2.5、50 ℃处理15 min而不失活，但在pH 7.0、55 ℃处理却遭破坏，黑曲霉NRRL 330的α-淀粉酶耐热性强，最适pH 3～5.0，最适温度60 ℃～70 ℃。

黑曲霉淀粉酶的耐酸与耐热性对酒精发酵至少有两大优点：

① 可在较高温度糖化，温度高则蒸煮醪黏度降低而有利发酵的进行。

② 在较高温度下糖化，可节约冷却用水，并可降低杂菌污染的机会，提高酒精收得率。

3 培养基组成份，培养条件对黑曲霉NRRL 330生产淀粉酶的影响和淀粉酶系若干酶对酒精产率的影响

以玉米、甘薯、麸皮、米糠、玉米浆、豆粕等原料，添加NaNO3、NH4Cl等无机氮源和MgSO4、CaCl2等无机盐，配制18种不同培养基来培养黑曲霉制备液体曲，观察不同培养基对生产淀粉酶的影响。

试验结果表明，在各种原料中以使用玉米粉6.0%，NaNO30.3%，MgSO40.05%～0.1%的培养基组成，其糖化酶活力最高且产酶稳定在250单位以上；培养基的初始pH以4.0～4.6时为最佳。试验也表明,初始pH的高低对生成淀粉酶的耐酸性无多大影响。虽然培养基中的含氮量对产酶有较大影响，但要因氮源不同而异。培养基中的磷含量对淀粉酶生成似无多大影响。Mg2+是植物生长必需的元素，也是发酵、呼吸链酶系的活化剂。向玉米培养基添加0.05%～0.1%的MgSO4可明显促进糖化酶的生成，由221 U/mL增加到250 U/mL以上。富金源孝称“合成培养基中添加Mg2+，对糖化酶之生成有利”，我们的实验证明天然原料培养基中添加Mg2+也可对产酶起到促进作用。

如表3所示，影响酒精得率的酶主要是糖化酶和麦芽糖酶，可是试验还发现虽然以玉米粉6.0%、NaNO30.3%、MgSO40.05%所组成的培养基，其糖化酶活力最高，达250 U/mL，麦芽糖酶活力在8 U/mL，但酒精发酵的结果其酒精发酵率竟与糖化酶活力仅148 U/mL，麦芽糖酶活力为7.9 U/mL的培养基(甘薯 0.5%，玉米粉 1.5%，麸皮 3%，NaNO30.1%)生产的液体曲相同，都在91%左右，估计这是由于蒸煮醪中添加的液体曲量为15%可能已过量，已远超实际需要量之故。

表3 三种培养基制成的黑曲霉NRRL 330 液体曲糖化发酵结果

从酒精发酵醪的失重来看，凡麦芽糖酶活力强的发酵速度较快(失重多)，而麦芽糖酶活力低而α-淀粉酶活力强的液体曲发酵速度较慢，这种现象可解释如下：麦芽糖酶强的，糖化醪中的葡萄糖生成量较多，可被酵母立即利用发酵成酒精，而液体曲之麦芽糖酶弱而α-淀粉酶强者，因糖化后所积聚的麦芽糖与糊精不能被酵母立即利用，须经过一段时间的延迟后才能被酵母发酵之故。

4 结语

60年代初国内还没有普遍建立科研成果鉴定与验收制度。由于液体曲的研究初告成功，酒精厂的新车间开始设计并建造，液体曲生产技术在行业交流中逐渐得到推广和应用。随着谷氨酸研究课题的上马，我们单位的液体曲研究项目也就宣告结束。我们的研究报告部分内容曾在1957年《化学世界》杂志上发表，全部报告则在1959年以上海市轻工业研究所、上海酒精厂和轻工业部发酵研究所的名义，以《应用液体曲制造酒精的研究》为书名由科技卫生出版社公开发行。液体曲制酒精的研究实际上就是糖化酶的研究，但其研究的内容比糖化酶要复杂，不仅要测定其糖化酶活力，还需测定α-淀粉酶活力，麦芽糖酶活力以及酒精发酵得率等项目，而糖化酶则是将液体曲滤去菌体、培养基残渣后，将液体曲滤液浓缩或稀释(如发酵酶活力高的话)到一定浓度，再添加食用级防腐剂和稳定剂即为商品液态糖化酶制剂出售。

我国经过几代人的努力，才使糖化酶的发酵产酶量达到今日之水平。如今糖化酶已广泛应用于酒精、酒、醋、酱等酿造制品的生产，更大量地应用于淀粉糖、氨基酸、柠檬酸、酵母、抗生素、维生素等许多产品的生产上，为国民经济的发展作出了重大贡献。淀粉原料生产酒精的工厂早已废弃了制曲这一工序，实现了酶法糖化，基本上实现了机械化自动化，劳动强度大大降低，简化了生产工序，节省了人力与场地。

由于市场需要量大，我们在国家六五、七五科技攻关项目高温淀粉酶的研究完成后，技术成果转让给太仓宏达电厂，并协助建立宏达制酶公司。在上世纪90年代该公司与丹麦诺维信Novozymes公司合资后，将发酵规模由100 m3扩大到1 600 m3，也因市场需要而将其全部用于糖化酶的生产，菌种是丹麦的,这个厂也已成为世界大酶制剂企业之一。