海洋链霉菌来源的脂肪酶OUC-Sb-lip2的异源克隆表达及其富集DHA的应用

王雪斐, 高坤鹏, 孙建安*, 毛相朝,2

1.中国海洋大学食品科学与工程学院，青岛 266000;2.青岛海洋科学与技术国家实验室海洋药物与生物制品功能实验室，青岛 266000

脂肪酶(EC 3.1.1.3), 广泛存在于动植物和微生物中，能够催化酯类化合物(长链酰基甘油，≥10 个碳原子)的合成与水解。脂肪酶作用过程发生在油水的界面之上，因此被称为“界面反应”，能够催化酯化、转酯、醇解和氨解等多种反应，其蛋白结构预测结果表明其属于 α/β 折叠水解酶家族。

脂肪酶广泛存在于自然界中，脂肪酶在催化反应时，所需条件简单，能耗较低，效率较高，脂肪酶在工业生产中成为重要的催化剂。在食品加工、洗涤工业、营养保健品、废水处理、油脂水解、精细化工和医药等行业都具有良好的应用前景[2,3]。然而传统工业中所使用的商业化脂肪酶或酯酶的种类少之又少，原因可能是大多数酶的存在形式不稳定，难以保存和多次重复利用；催化性质及反应效率不好等。因此，筛选性质稳定，反应效率高的脂肪酶对于商业化产业的发展十分重要。脂肪酶也具有从天然鱼油(藻油)中富集DHA的应用潜力。

ω-3多不饱和脂肪酸具有多种生理功能，受到人们广泛的关注和研究，其中ω-3脂肪酸是生物细胞膜磷脂的重要成分，是人体不能合成的必需脂肪酸，在人体发育中具有重要的作用[1, 2]。二十二碳六烯酸(DHA, 22 : 6ω-3)作为ω-3家族中最具代表性的成员，是与降低心血管疾病的几率[5,6], 维持神经系统[4]和免疫系统[6,7]以及抑制细胞内炎症水平有关的有效成分[8](与炎症因子释放有关)。ω-3多不饱和脂肪酸是生物细胞膜磷脂的重要组成成分，在人体发育中具有重要的作用[9,10]。海洋鱼油(甘油酯形式)仍然是人类ω-3 PUFAs的主要来源，一些海洋单细胞生物(如破囊壶菌，裂殖壶菌，隐孢子虫)是ω-3 PUFAs的替代来源[11,12]。然而，ω-3 PUFAs的总量在15%～45%之间；DHA的含量随种类不同而不同，通常在5%～40 %之间，DHA天然理想来源的裂殖壶菌通常也不超过40%。

天然鱼油是DHA的重要来源，但其中DHA的浓度受到鱼油来源的限制，如何提高天然鱼油中的DHA含量，是提高DHA相关产品使用价值的重要环节多项研究表明，与甘油酯型相比，乙酯型DHA吸收性较差[13,14]，其中DHA甘油单酯，甘油二酯型的人体利用度及友好度更高[15]。但是在天然来源中，ω-3 PUFAs的含量较低(14%～45%)，需要通过采用一定的手段进行富集。但是传统富集手段存在反应条件剧烈，副产物多，环境友好度低等缺点。近年来，以酶催化的方法得到更多青睐，酶法富集有诸多优点：催化效率高、反应条件温和、能耗低等。使用具有sn-1,3选择性的脂肪酶水解后，饱和脂肪酸或单不饱和脂肪酸被从甘油骨架上水解下来，DHA相应地在sn-2位富集(如图1-a所示)。而脂肪酸选择性水解是指脂肪酶偏向选择碳链长度不同及碳链饱和度不同的脂肪酸，将其从甘油骨架水解下来[16]。

本研究使用海洋链霉菌ATCC 15855T(StreptomycesbacillarisATCC 15855T)来源的脂肪酶OUC-Sb-lip2基因，并使用枯草芽孢杆菌WB800作为异源表达的宿主对其进行克隆表达后，研究了其酶学性质；接着探索了使用水解甘油三酯型DHA以将DHA富集到甘油单酯上的最优反应条件。

1 材料与方法

1.1 主要材料

表1 主要实验材料

1.2 主要仪器

表2 主要实验仪器

1.3 方法

1.3.1脂肪酶OUC-Sb-lip2的序列分析

将来源于海洋链霉菌(S.bacillarisATCC 15855T)[17]的OUC-Sb-lip2 DNA序列根据已报道的方法进行分类，然后对OUC-Sb-lip2基因进行多序列比对，利用ESPript 3.0网站对序列的比对结果进行在线展示和输出；使用SMART等在线网站对其蛋白序列进行进一步结构分析。

1.3.2枯草芽孢杆菌WB800/OUC-Sb-lip2菌株的构建

根据脂肪酶基因序列以及pP43NMK质粒载体基因序列，使用SnapGene 5.0.5及DNAMAN 8.0软件设计的引物序列如表3所示。以脂肪酶OUC-Sb-lip2的基因片段作为模板，使用无缝拼接技术构建重组质粒pP43NMK-OUC-Sb-lip2。测序正确后，将提取的重组质粒导入WB800宿主细胞，阳性克隆验证结果正确后，接种于低盐LB培养基(50 μg/mL，Kana)，20 ℃，220 r/min 低温培养24 h，诱导重组菌株WB800/OUC-Sb-lip2表达目的蛋白并分别收集发酵液上清和沉淀。最后使用SDS-PAGE分别检测上清液和细胞沉淀破碎液中目的蛋白是否正确表达。

表3 引物序列

1.3.3OUC-Sb-lip2的纯化

利用载体上的His-tag标签蛋白与镍柱结合这一性质，使用不同浓度梯度的咪唑-Tris-HCl 缓冲液(pH 8.0)洗脱下来，收集有蛋白洗出的相对应浓度咪唑的洗脱液。纯化结果将通过SDS-PAGE蛋白凝胶电泳进行检测, 并测定样品中蛋白质含量和脂肪酶酶活。

1.3.4脂肪酶酶活检测及定义

酶活测定：首先在1.5 mL的EP管中加入500 μL 100 mM，pH 9.0的 Tris-HCl缓冲溶液，然后置于相应温度的水浴锅中预孵育5 min；再向EP管中加入150 μL的粗酶液，随即立马加入40 μL底物溶液(对硝基苯酚棕榈酸酯，20 mM)。混合均匀后将各EP管密封后放在37 ℃的水浴锅中反应5 min；取出立即加入SDS溶液使酶失活，并吸取200 μL至96孔酶标板中检测A405值。脂肪酶酶活单位(U)定义为：1 min内获得 1 μmolpNP(对硝基苯酚)生成量所需要添加的酶量。

1.3.5脂肪酶OUC-Sb-lip2的酶学性质研究

对脂肪酶OUC-Sb-lip2的酶学性质进行了以下的研究：水解底物的碳链长度偏好性测定、最适温度及其温度稳定性测定、最适pH及其pH稳定性测定以及金属离子对酶活影响的研究。

1.3.6脂肪酶OUC-Sb-lip2在富集甘油单酯型DHA上的应用

使用脂肪酶OUC-Sb-lip2的发酵液上清的真空冷冻干燥产物催化水解反应。研究了反应温度、加酶量与底物的比例、乳化剂类型、反应体系中底物鱼油与水的比例以及反应时间对水解DHA甘油三酯的影响。反应结束后，使用乙酸乙酯萃取水解产物并吹干后取10 μL用1 mL正己烷(色谱级)复溶，避光保存待测。通过高效液相色谱检测(HPLC)研究甘油三酯水解率，甘油单酯生成率，还需要通过气相色谱-质谱联用(GC-MS)检测最终生成的甘油单酯中DHA的含量比例。

HPLC检测条件如下：

色谱柱：正相RX SIL硅胶柱(Agilent)

流动相：正己烷∶异丙醇=9∶1

流速：1 mL/min 柱温箱：36 ℃

紫外检测波长：205 nm 进样量：10 μL

GC-MS检测条件设置如下：

Agilent HP-INNOWAX Capillary Column 30 m*0.25 mm*0.25 μm 1993-113

进样口温度：240 ℃； 分流比设置为1∶20；

火焰离子检测器(FID)温度：230 ℃ ；EI电子能量为70 eV；

升温程序：初始温度170 ℃，并保持170 ℃ 3 min后，以1.5 ℃/min速率升温至280 ℃，维持8 min。

2 结果与讨论

2.1 OUC-Sb-lip2的序列分析

利用海洋链霉菌(S.bacillaris)全基因组测序的注释信息，使用ESPript 3.0在线网站对序列进行输出(图2-c)，使用SignalP 4.1 prediction软件预测序列发现OUC-Sb-lip2 第1-29个氨基酸(MKMSRLVAFSSSLLLGDSLA LTGAGIANA)为一段信号肽(图2-a)。后续使用SMART网站预测蛋白结构域的结果(图2-b)，也证明具有一段第二家族特征性保守序列(GDSL)。综合上述，OUC-Sb-lip2是属于脂类水解酶第II家族。

a: SignalP 4.1软件对OUC-Sb-lip2编码的信号肽预测结果; b: SMART对OUC-Sb-lip2基因编码的蛋白结构域的预测结果; c: ESPript 3.0多序列比对结果的输出图2 OUC-Sb-lip2基因编码信号肽及蛋白结构域的预测

2.2 脂肪酶OUC-Sb-lip2的表达和纯化结果

使用表3设计的引物，以OUC-Sb-lip2的基因片段为模板，扩增OUC-Sb-lip2序列后，利用无缝克隆技术将其与pP43NMK质粒连接，获得重组质粒。并将这些重组质粒成功转入宿主枯草芽孢杆菌WB800细胞中。阳性克隆验证核酸电泳如图3-a所示。

获得OUC-Sb-lip2的发酵上清液后，利用载体上的His-tag标签蛋白与镍柱结合这一性质，并使用不同浓度的咪唑-Tris-HCl 缓冲液(pH 8.0)洗脱下来，利用SDS-PAGE蛋白电泳来检测镍柱纯化的结果。纯化结果如图3-b所示，可以看出目标蛋白成功地被100 mmol/L浓度的咪唑洗脱下来。在置换溶液完成后，OUC-Sb-lip2的纯酶被收集到1.5 mL的EP管中于4 ℃生物冰箱中保存，等待进行下一步对酶学性质的研究。

2.3 脂肪酶OUC-Sb-lip2的酶学性质研究

研究脂肪酶OUC-Sb-lip2的最适水解底物，使用了从C2-C16 八种不同碳链长度的对硝基苯酚酯作为水解底物。从图4-a中可以看到，OUC-Sb-lip2对碳链长度 >8的对硝基苯酚酯的水解活性比较高，其中最适的碳链长度为C8, 对C10、C12、C14、C16底物的水解活性都大于或接近80%，且水解效果均好于短链底物。

从图4-b的结果可以看出，脂肪酶最适反应温度为40 ℃，在25 ℃～40 ℃范围内，脂肪酶的酶活逐渐上升；当反应温度大于40 ℃后，随着温度升高，酶活逐渐下降，在60 ℃时剩余酶活最低。在35 ℃～45 ℃范围内，剩余酶活力保持在90%以上。酶的温度稳定性如图4-c所示，在缓冲液中孵育24h后，在40 ℃时检测到最高的残余脂肪酶活性，剩余活性为97%，经过孵育60 h后，观察到所有实验组剩余酶活性均超过50%。结果表明，OUC-Sb-lip2对底物对硝基苯酚棕榈酸酯的水解活性表现出中高温稳定性。

a: 底物最适性的研究；b: 最适温度的研究；c: 温度稳定性的研究；d: 最适pH的研究；e: pH稳定性的研究；f: 金属离子对酶活的影响图4 脂肪酶OUC-Sb-lip2的酶学性质研究

如图4-d所示，OUC-Sb-lip2被检测到最高脂肪酶活性的pH为9(在Tris-HCl缓冲液中)，Tris-HCl缓冲液在很大程度上促进了酶的活性。由图4-e可看出，在pH 9.0(Tris-HCl 缓冲液)的条件下，OUC-Sb-lip2酶活最高且温度稳定性表现较好，因此，生产时将环境pH控制在9(Tris-HCl缓冲溶液)时酶活最高最稳定。10 mmol/L K+、Fe3+、1 mmol/L Ca2+、10 mmol/L Mg2+、10 mmol/L Zn2+、1 mmol/L Mn2+、Ba2+增强了酶活性，其中10 mmol/L Fe3+可使其增加150%以上(图4-f)；而10 mmol/L Ni2+、10 mmol/L Cu2+对酶活抑制作用显著，可使相对酶活降低到25%以下。在高等生物中，钙可以结合于关键的信号转导途径，在其中调节多种蛋白质的构象，活性和相互结合作用。 KATIYAR[18]等人研究了Fe3+对Candida rugosa脂肪酶(CRL)的脂肪酶酶活的影响，在使用CRL水解棉籽油的过程中添加了Fe3+溶液，并观察到酶活提升至原酶活的127%。而Fe3+对脂肪酶OUC-Sb-lip2的酶活促进明显高于CRL，这对工业生产具有一定的参考意义。

2.4 OUC-Sb-lip2在富集甘油单酯型DHA上的应用

如图5-a所示，在20 ℃至30 ℃温度梯度之间，甘油三酯水解率随着温度的升高而升高，曲线于30 ℃达到最高点(85.88%)；然而当反应温度高于30 ℃时，水解率随着温度的升高而降低，可能由于温度变高，酶逐渐失活。确定的最佳的反应温度是30 ℃；而水解产物中生成的甘油单酯(MAG)比例也是在30 ℃处达到最高，占水解产物总含量为25%。

随着加酶量/底物的比例的增加OUC-Sb-lip2的水解活性也在逐渐增加(图5-b)，当加酶量/底物的比例达到1 600 U/g时(水解率79%)，甘油三酯的水解率的变化趋于平缓，此时水解产物中生成甘油单酯占总组分含量最高。添加不同乳化剂的水解效果优势顺序为：司班系列(20、80)>曲拉通X-100 > 空白(无乳化剂有酶)> 吐温系列(20、80)，司班80对反应体系乳化效果最好，且达到甘油三酯最高水解率(81.45%)，其中水解产物中生成甘油单酯的比例占总组分的23.8%。如图5-d所示，脂肪酶OUC-Sb-lip2对DHA甘油三酯水解效率随着缓冲溶液的含量的增加，呈现先上升后下降的趋势；水解率和甘油单酯生成量最优点均为油/水(缓冲溶液)比例为2∶1(w/w)处，此时甘油三酯的水解率可达到82%，甘油单酯的生成量占总组分的比例为23%。

a: 温度(℃)；b: 加酶量/底物(U/g)；c: 乳化剂类型；d: 底物/缓冲液(w/w)图5 OUC-Sb-lip2在富集甘油单酯型DHA上的应用

在上述最优条件下研究反应时间梯度对水解DHA甘油三酯的影响。由图6-a可以看出，当反应时间到达24 h后水解率和甘油单酯的生成率的上升幅度明显减缓。24 h时，甘油三酯水解率测定为80.7%，而48 h后水解率仅仅增加了0.8%，推测脂肪酶的水解能力达到饱和。图6-b为空白实验组与在最佳条件下反应得到的水解产物的甘油酯组分HPLC检测结果，甘油单酯的出峰时间为8.337 min，最终水解率为81.9%，甘油单酯的含量是8.62 mg/mL。

对水解产物中的甘油单酯组分进行GC-MS检测，结果如图7所示，m/z342.2的峰是DHA甲酯的质谱信号。其中，DHA在甘油单酯中的脂肪酸占比为97.2%。与已经报道多种来源的脂肪酶相比，来自海洋链霉菌的OUC-Sb-lip2通过水解反应生成DHA甘油单酯显示出较为良好的效果。HOSSEINI等人[19]以及RICE[20]等人对南极假丝酵母和假丝酵母来源的脂肪酶分别进行了研究，发现两者通过水解反应富集DHA的含量分别为33.74%和72.10%。TAIWO等人[21]通过控制水解速率和程度，利用南极假丝酵母脂肪酶A(CAL-A)的脂肪酸选择性用于生产DHA浓缩物；CAL-A[21]没有区域选择性，水解藻油可得到82%DHA和11% DPA(占总脂比例)。综上，海洋链霉菌来源的脂肪酶展现出较好的DHA富集效果。

3 结论

来源于海洋链霉菌的脂肪酶OUC-Sb-lip2属于脂类水解酶第Ⅱ家族，将OUC-Sb-lip2应用于水解甘油三酯型DHA以将DHA富集到甘油单酯上，通过优化反应得到条件：鱼油与缓冲液比例为1∶1(w/v)，反应温度为30 ℃，加酶量与底物之比1 600 U/g，反应24 h；最终可达81.9%的水解率，DHA甘油单酯的生成量为8.62 mg/mL。