甲基营养菌MB200中mutL基因的突变及高耐甲醇菌株的筛选

闻东明, 黄罗冬, 杨青山, 申佩弘

广西大学生命科学与技术学院，广西 南宁 530004

甲基营养菌(Methylobacteriumsp.)是一类能够利用单碳化合物或非C—C键低碳化合物(如甲烷、甲醇、甲醛等)的微生物，由于这类细菌多为杆状，也称为甲基杆菌(Methylotrophicbacteria)[1]。其在自然界中分布广泛，早在20世纪初科学家就发现了有细菌存在甲基营养能力，但直到20世纪六、七十年代，它们的生理生化性质才逐渐引起研究者的重视[2]。研究报道共有100多个基因参与甲基营养菌的C1代谢过程，包括甲醇氧化、甲胺氧化、甲醛氧化和丝氨酸循环等[3]。

目前，利用微生物合成方法生产生物燃料、精细化学品和药物分子等 (如: 烃类燃料、大宗有机酸等) 主要使用葡萄糖作为碳源与能源，存在与人畜争粮争地的困局[4]。甲醇作为简单的甲基化合物，含有更多电子，可提供更多还原力，且市场价格低廉，不受季节与气候的影响[5]，同时也是很多工业生产的副产物及废弃物的主要成分，因而使用甲基营养菌生物合成途径具有明显的优势。如果能够根据甲基营养菌的这一特性对其加以利用，不仅可以降低污染，节约能源，还可以开辟出一条蛋白质或其它生物资源开发的新路径[5]。目前已有研究利用其生产氨基酸、单细胞蛋白、聚合物、胞外多糖、维生素和辅酶等物质[6]。

甲醇作为底物具有很多优点，但也存在如下关键问题：(1)具有毒性的甲醇在甲基营养型微生物培养过程中不易染菌，但甲醇代谢过程中产生的甲醛对细胞有毒害作用[7];甲醇浓度高或浓度波动大均会造成甲醛在细胞中大量积累，对细胞造成毒害;(2)作为菌株生长的唯一碳源，甲醇浓度低定会造成产量低，而过高的甲醇浓度会对菌株造成伤害，甚至导致菌株无法生长;(3)在以甲醇作为底物进行培养时，存在培养过程稳定性差的问题，实验结果难以重复[8]。

MutL基因是M. sp. MB200体内的一个突变修复基因，在大肠杆菌中，DNA复制错误主要通过甲基导向错配修复(MMR)途径进行纠正[9]。MutL蛋白通过调节从错配识别到DNA双链体解旋展开的一系列事件中发挥核心作用[10]。MMR首先通过需要ATP的MutS二聚体识别异常碱基对，随后MutL以ATP结合的形式与MutS-DNA复合物[11]相互作用，激活与MutH 相关的潜在内切酶，定位在不匹配的两侧[12]。接着，MutL将UvrD蛋白招募到带缺口的DNA底物上，启动DNA从切口展开。解开的新生DNA链被细胞核酸外切酶[13]，产生一个缺口，然后由DNA聚合酶III填补，最后的缺口被DNA连接酶封闭[14]。

目前少有关于甲基营养微生物耐受甲醇方面的报道，其耐受甲醇机理尚不清楚，因此获得高耐受甲醇的甲醇营养型微生物对工业生产和解析其耐受甲醇的机理具有重要意义。

本研究从本实验室保存的一株甲基营养菌M. sp. MB200野生菌株出发，通过三亲本结合构建突变修复基因Mutl插入的突变体，在甲醇浓度不断提高的环境中对MB200mTB进行不断地甲醇环境压力胁迫诱导突变，筛选获得高甲醇条件下生长的菌株，为进一步应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种与质粒

实验所用菌株M. sp. MB200(Nmr)和大肠杆菌E.coliDH5α为本实验室保存，所用质粒为pMD18-T(Ampr，TaKaRa公司)、pk18mod(Kmr)、pRK2073(Kmr)、pCM80(Tcr)。

1.1.2培养基

(1) 完全培养基(CM,g/L)：蛋白胨10，牛肉膏3，NaCl 5，pH 7.0。

(2) 基本培养基(MM，g/L)按照文献[15]配制，在培养甲基营养菌M. sp. MB200时在实验前向培养基中加入无水甲醇。

1.1.3常用抗生素及使用浓度

氨苄青霉素(Amp,50 μg/mL)、卡那霉素(Km,25 μg/mL)、四环素(Tc,25 μg/mL)、萘啶酮酸(Nm,50 μg/mL)。LA Taq聚合酶和T4-DNA连接酶购自TaKaRa公司。

1.1.4主要试剂

所需化学试剂均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；基因组DNA提取试剂盒、质粒DNA小量提取试剂盒、PCR产物纯化试剂盒和胶回收试剂盒等常用试剂盒购自Thermo公司。其他生物化学实验常用试剂购自上海生工公司。本实验所用引物也交由上海生工合成，所用引物见表1。

表1 实验所用引物

1.2 方法

1.2.1M. sp. MB200和突变菌株

MB200mTB基因组DNA提取、质粒DNA提取、回收、纯化、酶切、连接、转化等常规分子生物学操作均参照文献[16]进行。

1.2.2mutL基因和部分mutL片段(mutLps)的PCR扩增和DNA测序

参照Genbank中AM1的mutL基因序列，通过vector NTI软件设计引物，引物序列分别为MutL-F:5′-CCCAAGCTTACGAGGTGTGAGGATAGCGG-3′,MutL-R:5′-AACTGCAGGCGAGTCTGTATCGGTTCCC-3′,MutL-P1:5′-C-CCCTGCAGACCTCGAAGCTCCCCGAC-3′,MutL-P2:5′-AAAAGCTTCTCCGGCTCG-GGCCGAAGG-3′。以M. sp. MB200的基因组DNA为模板，其中MutL-F和MutL-R用来扩增完整mutL基因序列，MutL-P1和MutL-P2用来扩增mutL基因内的部分片段mutLps。将扩增产物连接到pMD18-T vector载体上(分别命名为pMD18T-MutL,pMD18T-MutLps)，分别导入DH5α，在含有X-gal、IPTG和Amp的LB平板上进行蓝白斑筛选，并提取质粒，酶切和测序验证。

1.2.3原始菌株M. sp MB200的耐甲醇性

将M. sp. MB200种子液5 mL接入甲醇浓度分别为0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%和2.2%的100 mL MM培养基中，于恒温摇床32 ℃、200 r/min培养48 h，测量原始菌株在不同甲醇中的生长曲线。

1.2.4MutL基因突变株MB200mTB的构建

将mutL片段(mutLps)用PstI与Hind III从T载体上酶切下，与同样用PstI与Hind III酶切的pK18mob载体连接,得到重组质粒pK18mob-mutLps，化学转化至E.coliDH5α中。在质粒载体pK18mob的多克隆位点上游200 bp处设计引物P3:5′-GGCCGATTCATTAATGCAGC-3′，以重组质粒pK18mob-mutLps为模板，分别以P3、MutL-P1为引物对其进行扩增，验证重组质粒pK18mob-mutlps连接的正反向。采用三亲本接合的方法[17]，将供体菌DH5α/pK18mob-mutLps，受体菌M. sp MB200，帮助菌DH5α/pRK2073同时培养至对数生长期，用0.85%生理盐水洗涤三次后将3种菌体按照DH5α/pK18mob-mutLps:M. sp. MB200:DH5α/pRK2073=1∶4∶1混合在一起，用移液器转移至含10% LB的MMI培养基的醋酸纤维薄膜上，置于超净工作台中晾干，于恒温培养箱中32 ℃倒置培养3 d。在此期间，每隔12 h用灭菌牙签从薄膜的菌落边缘挑取部分菌落，使用1 mL MM液体培养基于灭菌Ep管中清洗牙签，将其稀释涂布于含抗生素Nm 50 μg/mL、Km 25 μg/mL的MMI固体培养基上进行筛选，32 ℃培养72 h。得到的筛选子命名为MB200mTB(Nmr,Kmr)，即为突变株。

1.2.5突变株MB200mTB的耐甲醇诱导

往1.5%甲醇浓度的基础培养基中接入菌株MB200mTB，于恒温摇床30 ℃、200 r/min培养48 h，后接入10%菌液进1.7%(甲醇浓度增加0.2%)甲醇浓度的基础培养基中，恒温摇床30 ℃、200 r/min培养48 h。待生长稳定后继续接种10%菌液进甲醇浓度增加0.2%的基础培养基进行培养。对照组接种10%菌液进甲醇浓度增加1%的基础培养基进行培养。由于突变株MB200mTB的突变修复基因mutL被插入突变，不能修复在菌体生长繁育中产生的各种随机突变，在甲醇浓度不断增长的环境中，只有产生高浓度甲醇耐性的菌株可以存活，其余突变方向的菌株因不能适应高浓度甲醇环境而死亡，经过不断地传代驯化后，可筛选获得耐高浓度甲醇的菌株。

1.2.6表达载体pCM80-mutL的构建

使用分别含PstI酶切位点和Hind III酶切位点的引物MutL-F和MutL-R，从克隆载体pMD18T-MutL中扩增出mutL目的片段，胶回收后进行双酶切，然后与经同样酶切处理的载体pCM80连接，构建表达载体pCM80-mutL，化学转化至E.coliDH5α，筛选获得的阳性重组子命名为E.coliDH5α/pCM80-mutL。

1.2.7耐高甲醇浓度重组株MB200mHB菌株构建

由于MB200mTB的突变修复基因mutL被插入突变，不能修复菌体产生的各种随机突变，遗传稳定性差，需要将mutL基因回补到筛选到的耐高浓度甲醇菌株中，确保其遗传的稳定性。吸取耐甲醇诱导系统中可在7%甲醇浓度下正常生长的菌液，稀释后涂板于添加甲醇浓度为7%的MM固体培养基上，倒置于恒温培养箱中32 ℃培养72 h，随机挑选20个单菌落于7%的MM液体培养基进行培养。将培养至对数生长期的E.coliDH5ɑ/pCM80-mutL做为供体菌，随机挑选的20株MB200mTB做为受体菌，E.coliDH5α/pRK2073做为帮助菌，三亲本结合后于32 ℃培养箱中倒置培养3 d。每隔12 h用灭菌牙签从薄膜的菌落边缘挑取部分菌落，稀释涂布于含抗生素Nm 50 μg/mL、Tc 15 μg/mL的MM固体培养基，倒置于培养箱中32 ℃培养72 h。得到的20株筛选子MB200mTB/pCM80-mutL(Nmr,Tcr)即重组株分别命名为MB200mHB1-MB200mHB20。

1.2.8重组菌株遗传稳定性研究

将得到的20株MB200mHB菌株分别于7%甲醇含量的MM液体培养基中，恒温摇床32 ℃、200 r/min培养48 h，测量其OD600。 5%接种量接种于7%甲醇含量的MMI液体培养基中传代培养，32 ℃、200 r/min培养48 h，测量其OD600。连续传代10次，记录每次传代时菌株生长状况，待最后一次传代时进行平板涂菌培养，随机挑取单菌落进行质粒提取验证并送交生物公司测序，以确定重组菌株的遗传稳定性。

1.2.9重组菌株生长情况分析

先分别从培养有野生型菌株M. sp. MB200和重组菌株MB200mHB1的新鲜的平板上接一环菌株于10 mL指型瓶中活化培养，恒温摇床32 ℃、200 r/min培养使之达到对数生长后期。按0.5%的接种量将M. sp. MB200和MB200mHB1分别转接到100 mL新鲜的甲醇含量为1%的MM液体培养基中；另将MB200mHB1按0.5%的接种量接入甲醇含量分别为1%和7%的100 mL新鲜的MM液体培养基中，恒温摇床32 ℃、200 r/min进行培养，每6 h取样，使用分光光度计检测菌液OD600数值，绘OD600与时间的曲线图。

2 结果与讨论

2.1 菌株M. sp MB200的甲醇耐受

将菌株M. sp MB200种子液5 mL接入100 mL甲醇浓度分别为0.8%、1%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%和2.2%的基础培养基中，32 ℃、200 r/min摇床培养 48 h，测量原始菌株在不同浓度甲醇中的生长曲线及菌体量(图1)。 菌株在1%甲醇浓度培养基中生长速度最快，菌体量最大，在甲醇浓度增高的培养基中生长速度及菌体量递减，在2.2%甲醇浓度培养基中几乎不进行生长。

图1 菌株MB200的甲醇耐受生长曲线

2.2 突变体的构建与筛选

使用自杀质粒pK18mob构建含有mutL基因部分片段的重组质粒pK18mob-mutLps，通过三亲本结合将质粒pK18mob-mutLps 导入野生菌株M. sp. MB200中，经过同源单交换，mutL基因被pK18mob插入突变。经Nm、 Km抗性平板筛选，PCR验证，得到突变株MB200mTB(Nmr,Kmr)。

2.3 菌株MB200mTB的甲醇诱导突变

通过在不断增加的甲醇浓度对突变体MB200mTB连续传代培养，环境诱导突变。菌株经过若干代培养后，逐渐适应高甲醇浓度的环境。在经过80次连续传代后，菌株可在7%甲醇环境中具有较好的生长量。菌株MB200mTB在甲醇培养基中的耐甲醇结果如图2所示。

菌株MB200mTB经在甲醇培养基中反复传代驯化后，其对甲醇的耐受性有较大的提高。在未经甲醇诱导时，MB200mTB菌体在甲醇浓度1%的培养基中生长速度较为缓慢，在接种48 h后OD600值由0.05升至0.855。而经连续诱导培养后，在7%甲醇浓度含量培养基中，菌体生长得到大幅提升，在接种48 h后OD600值由0.05涨至2.583。可见，经过在不断升高的甲醇浓度环境中对菌体进行诱导突变，菌株的甲醇耐受性有极大的提升。

图2 MB200mTB甲醇诱导前后生长比较

2.4 重组菌株MB200mTB的构建

利用引物MutL-F和MutL-R，从克隆载体pMD18T-MutL中扩增出mutL目的片段，胶回收后进行双酶切，与经同样酶切处理的载体pCM80连接，构建表达载体pCM80-mutL(图3)，化学转化至E.coliDH5α，涂布到含Tc的X-gal和IPTG的平板上，对转化子进行筛选，提取质粒进行酶切验证，将阳性重组子命名为E.coliDH5α/pCM80-mutL。

图3 表达载体pCM80-mutL的构建

以筛选到的耐高浓度甲醇菌株MB200mTB为受体菌进行三亲本接合，将重组质粒导入MB200mTB中，构建重组菌MB200mTB/pCM80-mutL。平板培养后稀释涂布于含Nm 50 μg/mL、Tc 15 μg/mL的固体MM平板上进行筛选，32 ℃倒置培养72 h。共得到20株筛选子(Nmr,Tcr)即重组株命名为MB200mHB1-MB200mHB20。

2.5 重组株MB200mHB遗传性状稳定性

连续在7%甲醇培养基中传代培养10代，记录每一代菌液生长状况，其中有7株菌体生长状况优异，在7%甲醇浓度下具有较好的生长性状，其余菌株虽在7%甲醇浓度条件下可以生长，但菌体生长速度和菌体量未有较大提升(图4)。

A：1%甲醇浓度下菌株生长曲线;B：MB200mTB1不同甲醇浓度下生长曲线

在7%甲醇诱导培养基中，可以生存的菌株产生了明显的生长性状差异。既存在可以利用高浓度甲醇进行快速生长繁殖的菌株，也存在可生长缓慢的菌株。在通过三亲本结合进行遗传稳定性恢复后，MB200mHB1-MB200mHB20均在连续10代液体培养中OD600值及菌体量接近，生长稳定。

2.6 野生菌与重组菌生长情况分析

按0.5%的接种量将活化后的M. sp. MB200和MB200mHB1分别转接到100 mL新鲜的甲醇含量为1%的MM液体培养基中；另将MB200mHB1按0.5%的接种量接入甲醇含量分别为1%和7%的100 mL新鲜的MM液体培养基中，恒温摇床32 ℃ 200 r/min进行培养，每隔6小时取样，使用分光光度计检测菌液OD600数值，最后绘OD600与时间的曲线图(图4)，来衡量菌株的生长情况。

结果表明，在甲醇浓度较低的培养基中(1%甲醇浓度)，重组菌MB200mHB1生长速度更快，较野生菌M.sp. MB200提前8 h到达对数期，且其在稳定期的菌体量更大。在不同的甲醇浓度下，MB200mHB1具有不同的生长速度。当培养基甲醇浓度较低(1%甲醇浓度)，菌体快速生长且更早到达对数期，但由于培养基甲醇含量较低，在稳定期生长一段时间后开始出现菌体消融现象。而在7%浓度下，菌体生长量较在1%甲醇浓度下的生长量大，且在达到生长期后能够维持较长时间。

3 结论

本研究通过构建了甲基营养菌M. sp. MB200的mutL基因突变株MB200mTB，在甲醇不断增高的培养基中进行甲醇诱导突变，平板筛选到20株可以在7%甲醇环境中生长的菌株，三亲本结合进行遗传稳定性恢复后，获得20株可稳定遗传的重组菌株。其中有7株重组菌株的生长性状较野生菌株M. sp. MB200得到极大提升，不仅可以在7%甲醇条件下快速生长繁殖，且其菌体量较野生菌得到极大提升，甲醇耐受性提升近4倍。

甲醇作为甲基营养菌M. sp. MB200可利用的能源与碳源，菌体对甲醇的耐受能力一定程度上影响菌体的生长，进而限制了利用甲基营养菌进行各种生物合成的能力。通过对菌体进行连续的甲醇环境诱导突变，获得高甲醇耐受的菌株，可以进一步研究甲基营养菌利用甲醇的机制。同时可对高甲醇耐受的菌株进行针对性改造，获得性状优良的工程菌，为大规模的工业生产提供可能。