苦楝果水提物的抑菌效果研究

彭 红， 周 刚， 王颖思， 谢小保， 施庆珊

广东省微生物研究所，广东省科学院，华南应用微生物国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室， 广州 510070

据世界卫生组织(WHO)和联合国环境规划署(UNEP)统计，全球每年有数百万人因使用化学杀菌剂而引起中毒等诸多健康威胁，化学杀菌剂长期大量以及不正当使用使得很多微生物对其产生了不同程度的抗药性[1]。这促使科研人员从现有的具优异杀菌功能的天然植物中挖掘更多的活性成分，特别是从黄花蒿中提取到有效抑制疟疾的青蒿素的屠呦呦教授获得诺贝尔生理学或医学奖，以及在新型冠状病毒防治过程中，中草药制剂和疗法多次出现在诊疗方案中，这些必定会将我国的天然产物抑菌抗病毒研究和开发利用推向新的高潮。

科研人员已发现全世界约1600种以上的植物含有杀菌、杀虫、抗病毒活性物质，其中研究较多的是楝科植物，主要包括苦楝、川楝和印楝。早期以苦楝树的枝叶及果实为原材料制作的肥皂，有杀菌消炎作用，农村曾有用苦楝治疗小孩蛲虫的案例，即便现今，苦楝仍是天然便利的杀虫杀菌首选之物，淡水鱼养殖业习惯向养殖水域投放苦楝果防治鱼病，医药行业用苦楝果治疗各种真菌感染皮肤病(如癣、疥疮等)，并且，人体外用的中药配方中常用到苦楝果或苦楝皮。

本文通过苦楝果水提物对几种代表G-的大肠杆菌、铜绿假单胞菌，G+的金黄色葡萄球菌，芽胞菌的枯草芽胞杆菌，酵母菌的白色念珠菌，以及真菌的黑曲霉进行抑菌效果研究，充分揭示苦楝果的抑菌活性功效，为苦楝作为更广泛的抗菌药物开发应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

菌株:大肠杆菌(EscherichiacoliATCC25922)、金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusATCC9372)、白色念珠菌(CandidaalbicansATCC10231)、黑曲霉(AspergillusnigerATCC16404)由广东省菌种保藏与应用重点实验室提供。

试剂和培养基: PDA马铃薯琼脂培养基、NA营养琼脂培养基由广东环凯微生物科技有限公司提供。

仪器: 烘箱(广东环凯 DHG-9240A型)、粉碎机(长沙天创粉末技术有限公司 QXQM-0.4)、超声仪(上海安谱实验科技股份有限公司 2102T型)、气液两用隔膜真空泵(广东环凯 SZKB-3B)、旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司 N-1100)、高速离心机(湖南湘仪实验室仪器有限公司 H1850R)、恒温培养箱(广东环凯 DNP-9082)、洁净工作台(广东环凯 HK-C2)、高压灭菌锅(ZEALWAY G154 TR)、电子精密天平(SHIMADZU AUY220)。

1.2 苦楝果水提物制备

将购买的苦楝果(广州同仁堂药店，批号：20200108)用纯水清洗(以除去表面尘土)，沥干水分放入烘箱，65 ℃烘箱烘干至恒重，再对样品作粉碎处理，粉碎至颗粒直径≤1 mm，得到苦楝果粉，密封袋保存备用。称取100 g苦楝果粉置于1 000 mL蒸馏水中，室温下超声作用30 min，然后加热煮沸30 min，再次置于超声仪中作用30 min，用200目纱布过滤得到提取液，将滤渣加入到500 mL蒸馏水中煮沸30 min，用200目纱布过滤得到提取液，合并两次提取液，高速离心分离(10 000 r/min)10min，取上清液。用400目尼龙滤布减压抽滤，再用0.45 μm滤膜减压抽滤。并在旋转蒸发仪上保持真空度-0.1～-0.08 MPa，减压浓缩至100 mL，最终得浓缩液的浓度约为1.0 g/mL。经121℃灭菌20 min后，得到苦楝果提取物浓缩液，于4 ℃冰箱内保存备用。以蒸馏水稀释上述苦楝果提取物至0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25 g/mL。

1.3 悬液定量抑菌法测定苦楝果水提物的抑菌活性

分别取大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽胞杆菌单个典型菌落接种NA(普通营养琼脂培养基)斜面，培养后用PBS洗下并稀释配制成含菌量为5×107～5×108CFU /mL菌悬液，白色念珠菌、黑曲霉接种于PDA(马铃薯琼脂培养基)斜面，培养后用PBS洗下并稀释配制成含菌量为5×105～5×106CFU /mL菌悬液，备用。

分别取各浓度的苦楝果提取物及其稀释液1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25 g/mL，同时以无菌蒸馏水作为空白对照，量取各药液及空白对照9 mL于各无菌试管内，置 20 ℃±1℃水浴中 5 min 后，分别加入1 mL菌悬液，轻轻摇动混匀，于37℃条件培养，黑曲霉于30℃条件培养，作用至预定时间10 min、30 min、1 h、3 h、5 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h分别对各试管内加菌药液进行活菌计数，与相应时间段的各空白对照中该菌的菌量进行对比，每个样品做3个平行，取平均值并使用按照下面的公式计算其抑菌率。

2 结果

2.1 苦楝果水提物对革兰氏阴性菌的抑菌效果

为了评价苦楝果水提物对革兰氏阴性菌的抑菌效果，选取大肠杆菌和铜绿假单胞菌作为试验对象，分别测定了不同浓度的苦楝果水提物对上述两种菌株在10 min、30 min、1 h、3 h、5 h、10 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h和120 h各时间的抑菌率，其试验结果见表1。

如表1所示，1.0 g/mL、0.5 g/mL和0.33 g/mL苦楝果水提物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌作用时间在5 h就达到最高抑菌率> 99.99%，之后一直保持> 99.99%的抑菌效果；0.25 g/mL苦楝果水提物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌作用时间在12 h达到最高抑菌率> 99.99%，之后一直保持> 99.99%的抑菌效果。

表1 不同浓度的苦楝果水提物在不同时间对革兰氏阴性菌的抑菌率(%)

2.2 苦楝果水提物对革兰氏阳性菌的抑菌效果

苦楝果水提物对革兰氏阴性菌具有较好的抑菌作用，为了进一步评价苦楝果水提物对革兰氏阳性菌的抑菌效果，选取金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为试验对象，分别测定了不同浓度的苦楝果水提物对上述两个菌株在不同时间点的抑菌率，其试验结果见表2。

表2 不同浓度的苦楝果水提物在不同时间对革兰氏阳性菌的抑菌率(%)

如表2所示，1.0 g/mL苦楝果水提物对金黄色葡萄球菌的作用时间在5 h就达到最高抑菌率>99.99%，之后一直保持> 99.99%的抑菌效果。0.5 g/mL、0.33 g/mL、0.25 g/mL苦楝果水提物对金黄色葡萄球菌作用时间在12 h就达到最高抑菌率：99.97%、99.74%和85.12%，之后抑菌率随时间递增而下降，0.25 g/mL在作用至48 h抑菌率降至0。1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25g/mL苦楝果水提物对枯草芽孢杆菌作用时间在12 h达到最高抑菌率：99.33%、95.25%、75.26%和65.25%，之后抑菌率随时间递增而下降，0.33 g/mL在作用至72 h抑菌率降至0，0.25 g/mL在作用至48 h抑菌率降至0。

2.3 苦楝果水提物对真菌的抑菌效果

苦楝果水提物对革兰氏阴性菌和阳性菌都有较好的抑制作用，为了进一步评价苦楝果水提物对真菌的抑菌效果，选取白色念珠菌和黑曲霉作为试验对象，分别测定了不同浓度的苦楝果水提物对上述两个真菌菌株在不同时间点的抑菌率，其试验结果见表3。

如表3所示，1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25 g/mL苦楝果水提物对白色念珠菌作用时间在12 h达到最高抑菌率：90.68%、70.35%、65.25%和60.50%，之后抑菌率随时间递增而下降，0.5 g/mL在作用至96 h抑菌率降至0，0.33 g/mL在作用至72 h抑菌率降至0，0.25 g/mL在作用至48h抑菌率降至0。与此同时，1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25 g/mL苦楝果水提物对黑曲霉作用时间在12h达到最高抑菌率：92.65%、89.25%、78.20%和58.25%，之后抑菌率随时间递增而下降，0.33 g/mL在作用至120 h抑菌率降至0，0.25 g/mL在作用至48 h抑菌率降至0。

表3 不同浓度的苦楝果水提物在不同时间对酵母和真菌的抑菌率(%)

3 讨论

国内外多位学者研究了苦楝的杀菌抗菌生物活性。魏琴等[2]从苦楝仁的提取物对小麦赤霉病原菌(Graminearumsehw)、辣椒疫霉病原菌(Phytophthoracapsici)、苹果炭疽病原菌(Colletotrichumgloeosporioides)三种真菌菌丝和孢子的生长有一定的抑制活性，对变形杆菌(Proteusvulgaris)有较强的抑制作用。张峰等[3]用苦楝叶挥发油25 mg/mL、50 mg/mL、75 mg/mL 和 100 mg/mL分别处理大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉，均有较强的抑制效果，其抑制强弱顺序为：黑曲霉 > 大肠杆菌 > 金黄色葡萄球菌。而本研究中苦楝果水提物对几种菌的抑菌效果依次为：大肠杆菌 > 铜绿假单胞菌 > 金黄色葡萄球菌 > 白色念珠菌 > 枯草芽孢杆菌 > 黑曲霉，不同的研究发现微生物对苦楝提取物的敏感顺序不一样，一方面是由于使用了不同的苦楝部位，如叶子、果实、树根等，不同部位的提取物具有不同的活性成分；另一方面是因为不同的研究使用了不同的提取方法，而已经有研究证明用不同的提取方法对相同的部位进行提取，会提取到不同的活性成分，或者活性成分的比例也有差别；本研究中使用苦楝的果实进行超声加水提，最大限度的避免了提取液对抑菌效能的影响。

马玉翔[4]用苦楝果仁甲醇提取的有效成分，以琼脂稀释法测得对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度(MIC)分别为 30 mg/mL、7.5 mg/mL、7.5 mg/mL，最小杀菌浓度(MBC)分别为 30 mg/mL、15 mg/mL和15 mg/mL。翟兴礼等[5]将不同浓度的苦楝果实提取液，测定其对巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的抑菌作用，发现抑菌作用随提取液浓度增加而增强，对枯草芽孢杆菌的抑菌活性最大。彭红[6]等发现从苦楝中提取的苦楝素对白色念珠菌浮游菌生长及其生物膜的形成具有较好的抑制效果，同时苦楝素与BIT对白色念珠菌具有协同抑菌作用。SANNA[7]对苦楝果甲醇提取物和4种苦楝果类柠檬苦素的细胞毒性、抗病毒和抗分枝杆菌活性。对苦楝果甲醇提取物 3-α-紫杉醇和库拉酸甲酯显示出良好的抗分枝杆菌活性(MIC值分别为 29 μmol/L 和 70 μmol/L)。PIGNATA[8]研究了苦楝树的化学参数与城市环境之间的关系，发现苦楝树对交通及工业造成的空气污染非常敏感。胡仁火[9]等在研究广玉兰、红叶石楠、木豆、迎春花、苦楝和红叶李等 6 种校园绿化植物滞尘、抑菌和杀菌的研究中，发现苦楝的抑菌效果最优，抑菌率为 88.9%。杨小凤等[10]用苦楝醇浸剂(1∶4)能抑制 7 种癣菌(许兰氏黄藓菌、黄色毛癣菌、红色皮肤癣菌、铁锈色小芽孢癣菌、奥杜盎氏小芽孢癣菌、羊毛状小芽孢癣菌、同心性毛癣菌)和星形奴卡氏肺炎菌的生长。姜萍等[11]研究了苦楝树皮乙醇提取物对绿色木霉和黑曲霉有很好的抑菌活性。CHINNASAMY[12]利用苦楝叶提取物生物合成银纳米颗粒(MA-AgNPs)，具有增强抗菌、伤口愈合、抗糖尿病和抗氧化活性。ABBAS[13]以苦楝花在不同溶剂中对3种真菌(黑曲霉、烟曲霉、黄曲霉)进行抑菌实验，苦楝花甲醇提取物对黄曲霉的抑菌活性最强，抑菌圈为(19.6±0.66) mm。二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇提取物的抑菌活性分别为(18±0.57) mm、(18.6±0.88) mm 和(18±0.66) mm。正丁醇提取物对黑曲霉的抑菌活性较低，抑制区为(13.6±0.88) mm。二氯甲烷和甲醇提取物对黄曲霉的最低抑菌浓度为(13.909±1.5) μg/mL。认为苦楝花提取物具有良好的抗真菌活性。从以上文献比较，从苦楝中提取有效成分常采用有机溶剂如乙醇、甲醇、乙酸乙酯等提取，但是有机溶剂提取的苦楝有效物质，水溶性差，抑菌实验中需再次经有机溶剂(如乙醇)溶解才能进行，当样品遇水，苦楝有效物析出，并且乙醇本身对目标菌株的生长有抑制作用，这都严重影响抑菌实验效果评价。本文以传统“水提”加“超声”辅助的简化提取工艺，充分快速提取苦楝果的有效成分，以悬液定量抑菌法测定苦楝果水提物的抑菌活性，保证了抑菌实验免受乙醇等萃取剂的外因干扰，真实反映了苦楝提取物优异的抑菌活性。

综上所述，苦楝不同部位的提取物对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌，都具有很好的抑制甚至杀灭作用，但是由于使用的苦楝部位和提取方法的差异，导致不同的抑菌和杀菌活性，但我们使用的苦楝果超声加水提的简便方法依然可以提取到抑菌活性成分，并且在很低的浓度(1.0 g/mL、0.5 g/mL、0.33 g/mL和0.25 g/mL)就具有较好的抑菌活性，该提取方法可以推广到苦楝树叶和树皮等抑菌活性成分的提取，本研究结果真实反映了苦楝水提物对几种微生物优异的抑菌活性，但其对目标菌株的作用机理，真正起抑菌作用的活性成分等，有待进一步的深入研究和解析，从而发现新的抑菌活性分子和明确抑菌作用机制，为开发新的抑菌药物积累物质基础和骨架结构。

4 结论

(1) 苦楝果水提物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌和黑曲霉的生长都具有较好的抑制作用。

(2) 苦楝果水提物对革兰氏阴性菌大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌效果最好，对芽胞杆菌和酵母、真菌的抑菌效果相对较差，抑菌效果强弱依次为：大肠杆菌>铜绿假单胞菌>金黄色葡萄球菌>白色念珠菌>枯草芽孢杆菌>黑曲霉。

(3) 苦楝果提取物对几种微生物的抑菌具有浓度依赖性，浓度越高，抑菌效果越好，1.0 g/mL水提物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌作用时间在5 h抑菌率大于99.99%，之后一直保持了极强的抑菌作用。0.5 g/mL水提物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌作用时间在5 h抑菌率大于99.99%，之后一直保持了极强的抑菌作用，对枯草芽孢杆菌作用时间在12 h抑菌率达到最高99.97%，之后抑菌率随时间递增而下降。而低浓度的0.25 g/mL水提物对大肠杆菌、铜绿假单胞菌作用时间在12 h抑菌率才大于99.99%。

(4) 苦楝果水提物抑菌效果与作用时间相关，极强抑菌效果的试验组在5 h就达到最好，之后一直保持极强的抑菌效果，而抑菌效果不是极强的试验组在作用到12 h达到最好抑菌效果，之后随时间递增而抑菌效果降低。