固相萃取-高效液相色谱法测定碳酸饮料中7种合成着色剂

时间：2024-07-28

张敏

上海工微所科技有限公司，上海 200233

着色剂是使食品着色和改善食品色泽的物质，通常包括食用合成色素和食用天然色素两大类等[1]。食品本身的色泽在被加工、贮存以及运输过程中，因受到了外界因素(如光照、加热、酸碱腐蚀等)的影响，自身原来的颜色就会发生褪变，进而影响到食品的外部感观和性状[2]。天然色素在加工保存过程中容易褪色和变色，成本又高，相比之下，合成色素色彩鲜艳，着色力好，价格便宜，所以合成色素已在食品中被广泛应用[3]。但是，违规使用合成色素会危害人体健康，导致生育力下降，引发儿童行为过激，损伤智力发育，有些色素在人体内可能转换成致癌物质，特别是偶氮化合物类合成色素的致癌作用更明显[4]。为了避免滥用合成着色剂，我国GB2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[5]对允许使用的合成着色剂的种类、适用范围和最大使用限量都作出了明确的规定。目前，合成着色剂的主要检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法、薄层色谱法、示波极谱法等[6]。

GB5009.35—2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》规定了食品中柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝和赤藓红这7种合成着色剂的高效液相色谱测定方法[7]。该国标方法的前处理需要经过吸附-解析或液-液萃取过程，步骤繁琐，易造成目标物的损失，导致结果不准确，回收率偏低等问题。本实验针对碳酸饮料样品在此方法的基础上进行了改进优化，操作快速简便，结果准确可靠。最终得出较高效的前处理方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：市售碳酸饮料

试剂：柠檬黄1 000 μg/mL标准品，新红1 000 μg/mL标准品，苋菜红1 000 μg/mL标准品，胭脂红1 000 μg/mL标准品，日落黄1 000 μg/mL标准品，亮蓝1 000 μg/mL标准品，赤藓红1 000 μg/mL标准品(北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司)；氨水(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，DIKMA)；乙酸铵(色谱纯，MACKLIN)。

1.2 仪器与设备

Thermo Scientific U3000高效液相色谱仪(WPS-3000SL 自动进样器，DAD-3000二极管阵列检测器，ChromeleonTM7色谱工作站)；METTLER TOLEDO电子天平MS204TS/02；数显恒温水浴锅HH-4(国华电器有限公司)；KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；固相萃取仪；固相萃取小柱CNW poly-sery PWAX SPE Cartridge 150 mg，6 mL；氮吹仪PRESSURE GAS BLOWING CONCENTRATOR DC12H。

1.3 实验方法

1.3.1标准曲线的配制

准确吸取200 μL柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红标准品于10 mL容量瓶中，加水溶解配置成20.0 μg/mL的标准储备溶液，再逐级稀释得到的0.50 μg/mL，1.00 μg/mL，2.00 μg/mL，5.00 μg/mL，10.00 μg/mL的标准工作溶液。

1.3.2色谱条件

色谱条件：色谱柱SunShell C18(5 μm，4.6 i.d.*250 mm)；保护柱SunShell Guard Cartridge Column RP；柱温30 ℃。

流动相：A为甲醇，B为0.02 mol/L的乙酸铵溶液；流速为1.0 mL/min；测定波长为254 nm，529 nm，630 nm；进样量：10 μL。梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件

1.3.3样品前处理

称取1.0 g(精确至0.000 1 g)样品于玻璃试管中，超声10 min，待净化。poly-sery PWAX小柱使用前依次用5 mL甲醇，5 mL水活化。将全部待净化液全部上样至小柱，弃去流出液。依次用5 mL甲醇，5 mL水淋洗小柱，并吹干。最后用6 mL氨水-甲醇(10+90)洗脱，收集洗脱液。洗脱液于50 ℃水浴下氮气吹至余0.3 mL，用初始流动相定容至1.0 mL，涡旋均匀后，过0.45 μm水相滤膜上机。

2 结果与讨论

2.1 液相色谱图

通过对液相条件优化，选择最佳液相色谱条件。其中亮蓝为非偶氮类酸性染料，主要有3个同分异构体，为3个同分异构体的混合物，一般大致组成为间位磺化物∶对位磺化物∶邻位磺化物=(75～85)∶(15～20)∶(0～8)[8]。故将三个峰视为整体考虑。7种合成着色剂标准品液相色谱图如图1所示。

1-柠檬黄；2-新红；3-苋菜红；4-胭脂红；5-日落黄；6-亮蓝；7-赤藓红图1 7种合成着色剂液相色谱图

2.2 线性范围和检出限

采用外标校准曲线法测定7种合成着色剂标准溶液的含量，以标准工作溶液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，建立回归方程。将标准工作溶液逐级稀释，以信噪比S/N=3考察了7种合成着色剂的检出限。在0.50 μg/mL～10.00 μg/mL范围内线性良好，满足检测需求。结果见表2。

表2 7种着色剂线性方程、保留时间、相关系数、测定波长及检出限

2.3 前处理条件优化

2.3.1样品pH调整

poly-sery PWAX固相萃取柱是混合型弱阴离子交换小柱，对强酸性化合物有很好的选择性。所选样品成分中含有柠檬酸、二氧化碳等，pH在3左右，提供了酸性环境。故未对样品pH进行调整，但若选取的样品是非酸性环境下，建议加入适量甲酸调整pH。

2.3.2淋洗液选择

在固相萃取淋洗过程中，分别考察对比了5 mL甲醇甲酸(6+4)+5 mL水(A)、5 mL水(B)、5 mL甲醇+5 mL水(C)三种淋洗液对结果的影响。7种合成着色剂在三种淋洗体系中回收率如表3所示。

表3 7种合成着色剂在三种淋洗体系中回收率

结果发现：除赤藓红外其余6种合成着色剂在三种淋洗体系中回收率为A>C>B。A淋洗体系回收率略高于C淋洗体系，C淋洗体系回收率比B淋洗体系高5%～9%。赤藓红在A淋洗体系中回收率远低于B、C淋洗体系。可能由于赤藓红本身耐酸性差，在甲醇甲酸(6+4)淋洗过程中提前被洗脱。

2.3.3复溶液选择

在水浴氮吹及复溶过程中，分别考察了吹干样液+1 mL水复溶(A)、吹干样液+1 mL初始流动相复溶(B)、余0.3 mL样液+1 mL水复溶(C)、余0.3 mL样液+1 mL初始流动相复溶(D)四种操作对结果的影响。7种合成着色剂在四种条件下回收率如图2所示。

图2 7种合成着色剂在四种操作下回收率

结果发现：7种合成着色剂在四种条件下回收率D>C>B>A。样液在吹干后，色素易附着在玻璃管壁上，复溶时无法完全溶解，容易造成损失。在选择复溶液时，水和初始流动相皆可，但比较之下，初始流动相对于回收率有更大的正相作用。

2.4 回收率和重复性

选择某品牌碳酸饮料进行3个不同添加水平加标实验。加标水平分别为：1 mg/kg、4 mg/kg和8mg/kg，每个加标水平重复六次。结果如表4所示。结果表明，方法回收率在84.8%～96.1%，相对标准偏差在0.81%～2.50%，满足实验要求。

2.5 与聚酰胺吸附法、液-液分配法的比较

根据GB5009.35—2016《食品安全国家标准食品中合成着色剂的测定》，采用聚酰胺吸附法、液-液分配法对加标样品进行回收率测定。

聚酰胺吸附法：称取5.0 g(精确至0.000 1 g)样品于100 mL烧杯中，超声除二氧化碳。样品溶液加热到60 ℃，将1 g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入样品溶液中，搅拌，以G3垂融漏斗抽滤，用60 ℃ PH=4的水洗涤三次，用甲醇-甲酸溶液(6+4)洗涤三次，再用水洗涤至中性，用10 mL乙醇-2%氨水-水混合溶液(7+2+1)解吸5次，直至完全解吸，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5 mL。经0.45 μm微孔滤膜过滤，进样。

表4 7种着色剂的回收率结果(n=6)

液-液分配法：称取5.0 g(精确至0.000 1 g)样品于100 mL烧杯中，超声除二氧化碳。将样品溶液倒入分液漏斗，加2 mL盐酸、10 mL三正辛胺-正丁醇(5%)溶液，振摇提取，分取有机相，重复提取三次，合并有机相，用饱和硫酸钠溶液洗2次，每次10 mL，分取有机相，放蒸发皿中水浴加热至10 mL，转移至分液漏斗中，加10 mL正己烷，混匀，加5 mL 2%氨水溶液提取，重复三次，合并氨水溶液层，用10 mL正己烷洗2次，氨水溶液层加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至5 mL。经0.45 μm微孔滤膜过滤，进样。

7种合成着色剂在三种测定方法下回收率如图3所示。

图3 7种合成着色剂在三种测定方法下回收率

结果发现：7种合成着色剂在三种测定方法下回收率为固相萃取法>聚酰胺吸附法>液-液分配法。其中赤藓红采用聚酰胺吸附法时回收率远低于其他两种方法，因为其余6种合成着色剂能和聚酰胺间形成氢键而被牢牢吸附，但赤藓红只有羧基，氢键作用弱，被聚酰胺粉吸附后，会被甲醇-甲酸洗脱，故GB5009.35—2016采用液-液分配法。但聚酰胺吸附法和液-液分配法都步骤繁琐，耗时多，所需试剂较多，在操作过程中易损失，总体不如固相萃取法。