双歧杆菌的分离培养和生理功能研究进展

杨 淼， 赵笑笑， 宋 馨， 夏永军， 艾连中， 熊智强

上海理工大学医疗器械与食品学院，上海食品微生物工程技术研究中心，上海 00093

肠道微生物菌群种类和数量繁多，主要包括厌氧菌和兼性厌氧菌。正常情况下肠道菌群维持在平衡状态，但饮食结构失衡、抗生素滥用、生活作息不规律和肠道感染等因素会造成肠道菌群失调，导致腹泻、便秘、色斑、内分泌失调和免疫力下降等代谢疾病[1]。双歧杆菌是肠道健康指示菌，其丰度受年龄、健康状况和精神压力等因素影响[2]。在健康婴儿肠道内双歧杆菌丰度占肠道微生物90%以上，随着年龄的增加，人体内双歧杆菌的种类和丰度逐步下降，老年人体内的双歧杆菌丰度很低。但国内外长寿老人的双歧杆菌含量与年轻人差异不大，这可能是其长寿的重要原因。双歧杆菌具有促进肠道健康、延缓衰老、提高人体免疫、降血糖、降血脂和降胆固醇等生理活性[3,4]。本文介绍双歧杆菌的特征分类、分离方法和生理活性功能，以期对双歧杆菌的开发应用提供帮助。

1 双歧杆菌的特征和分类

双歧杆菌是革兰氏阳性菌，属于细菌域、放线菌门、放线菌纲、双歧杆菌目、双歧杆菌科。双歧杆菌已发现7个属、32个种，广泛分布存在于肠道、粪便、口腔和乳汁等环境中(表1)。双歧杆菌生理特性包括过氧化氢酶阴性、氧敏感、GC含量高、生长条件严格、最适生长温度在37 ℃～41 ℃、最适生长pH在6.5～7.0[5]。形态上多为乳白色或微黄色的球形、扁平形或尖锥形，末端分叉呈V形、Y形或长条弯曲状，Ca2+、N-乙酰氨基葡萄糖和部分氨基酸会影响其细胞形态。代谢特征包括在人体内能合成多种维生素，发酵方式为异型乳酸发酵，能产生醋酸、乳酸和丙酸等多种短链脂肪酸，能水解乳糖、葡萄糖、甘露糖和低聚果糖等寡糖，具有特殊的“双歧”或“Bifido shunt”糖代谢途径。由于双歧杆菌通过果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶(F6PPK)水解葡萄糖，因此F6PPK作为标志性酶用于双歧杆菌的分类和鉴定。

2 双歧杆菌的分离培养

MRS(De Man,Rogosa,Sharpe)、哥伦比亚(Columbia)、WC(Wilkins-Chalgren)和TPY(Tryptone-peptone-yeast)琼脂培养基是目前分离双歧杆菌常用的基础培养基。在此基础上改良的BSM(Bifidobacteriumselective medium)、BFM(Bifidobacteriummedium)、RB(RaffinoseBifidobacterium)、MTPY(Modified TPY)和RP-MUP(Raffinose-Propionate Lithium Mupirocin)等培养基具有更高的分离效率[1]，但存在成分复杂、价格昂贵、灭菌和冷却温度严格以及需要调整pH等缺点[2]。FERRARIS等[7]优化出WCB(Wilkins-Chalgren forBifidobacterium)和WCBM(Wilkins-Chalgren forBifidobacteriumMupirocin)选择性培养基，既易制备，又具有良好的筛选效果，与样品通过16S rRNA定量的双歧杆菌种类相近，可作为分离双歧杆菌的首选培养基。在此基础上，采用表2策略可进一步提升双歧杆菌的分离效率。

表1 双歧杆菌的来源和分类[6]

策略1：添加显色剂。显色剂用于辨别菌落，在一定程度上提高培养基的选择性。例如CHEVALIER等[8]在培养基中加入X-α-Gal作为显色剂，由于双歧杆菌属具有较强的α-半乳糖苷酶活性，能水解X-α-Gal释放吲哚，使菌落呈现蓝色，可以快速的区分双歧杆菌与乳酸杆菌和乳酸链球菌。另外，溴甲酚紫[9]作为酸碱指示剂可添加在培养基中。若菌落产酸，周围则产生黄色圈，可区分双歧杆菌和不产酸细菌。但添加显色方法也存在局限性，部分其它种类乳酸菌不但有很强的产酸能力，也具有很高的半乳糖苷酶活性，通过显色不能区分双歧杆菌和这些乳酸菌。

策略2：添加抗生素。万古霉素、四环素、青霉素、林肯霉素、红霉素、氯霉素和杆菌肽对双歧杆菌有较强的杀伤力，而双歧杆菌对新霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素等氨基糖苷类抗生素和多粘菌素普遍不敏感[10]，因此，添加这类不敏感的抗生素，可提高双歧杆菌分离培养基的选择性。虽然伯杰氏系统细菌学手册表明添加莫匹罗星能够满足双歧杆菌的分离，但梭状芽胞杆菌[11]等许多厌氧菌具有莫匹罗星抗性。因此， VLKOVA等[12]联合添加诺佛沙星(200 mg/L)、莫匹罗星(100 mg/L)和冰醋酸(1 mL/L)的培养基能够抑制梭状芽胞杆菌生长，但对双歧杆菌生长没有影响。对于粪便等复杂环境样品，由于微生物数量多、种类复杂，要分离双歧杆菌的同时，抑制类杆菌属、梭菌属、球菌属等细菌和真菌，在培养基中添加复合抗生素是一个很好的选择。但从乳制品等简单样品中分离双歧杆菌，国际乳品联盟建议添加50 mg/L莫匹罗星用于抑制其他乳酸菌的生长。

表2 双歧杆菌的分离培养基

策略3：添加促双歧杆菌生长因子。双歧杆菌生长条件苛刻，营养物质应尽可能丰富，可添加小分子肽和低聚糖等益生元显著促进双歧杆菌的生长。在MRS培养基中，添加马血清、Fe2+、维生素K和精氨酸等营养物质提高双歧杆菌生长速度，还可以添加L-半胱氨酸盐酸盐、维生素C和丙酮酸钠等还原剂制造厌氧环境，有利于双歧杆菌的生长。在哥伦比亚培养基中添加棉子糖作为选择性碳源[13]，并且加入氯化锂和丙酸钠抑制腐败菌的生长，或冰醋酸和莫匹罗星联用，通过降低培养基pH以抑制其他细菌的生长。

3 双歧杆菌功能活性

肠道是食物消化吸收的场所，为人体各项生命活动提供所需的原料。肠道内双歧杆菌的丰度直接影响人体健康状况，研究表明双歧杆菌能促进肠道健康、调节“三高”、延缓衰老和提高机体免疫力等多种生理功能(表3)。

表3 双歧杆菌的生理功能

3.1 促进肠道健康

当人体处于亚健康状态和肠动力不足时，肠道内有益菌丰度下降，而腐败菌和致病菌大量繁殖并分泌各种毒素，使肠黏膜屏障受损，最终导致机体免疫力下降。机体肠道菌群紊乱，极易出现腹泻、便秘和其他肠道疾病。补充双歧杆菌能显著改善肠道微生态失衡、治疗腹泻、降低肠内毒素水平和改善肠道黏膜屏障功能[18]。双歧杆菌可产生多种不饱和脂肪酸，降低肠道pH及产生细菌素“Bifidin”[19]和过氧化氢，抑制或杀死腐败菌和致病菌，并通过糖蛋白和脂磷壁酸等大分子与肠黏膜细胞表面的特异受体结合，占领腐败菌和致病菌的定植位点，与其形成生物拮抗，为机体内有益菌定植提供条件。

3.2 降胆固醇

目前双歧杆菌降解胆固醇机制有共沉淀[22]和同化[23]两种理论。在分子水平上，双歧杆菌能影响胆固醇代谢中关键基因和酶系的表达。SALEHI-ABARGOUEI A等[29]认为双歧杆菌活细胞降解胆固醇是通过同化和共沉淀共同作用，而死细胞只通过共沉淀作用。当pH升高时，胆固醇会从共沉淀中完全释放。ZANOTTI等[25]研究了17种双歧杆菌菌株的胆固醇降低能力，证明模式菌株长双歧杆菌PRL2010提高了负责转运胆固醇的蛋白和还原酶的表达水平。双歧杆菌的降胆固醇机制还与胆固醇合成分解代谢中多种酶系的活性直接相关，其中β-羟基-β-甲基-戊二酸单酰辅酶A(HMGCoA还原酶)和7α-胆固醇羟化酶(CYP7A1)是关键酶，胆固醇水平的高低可以用这两种酶的活性作为参考[26,27]。

3.3 控制血糖

糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病，由胰岛素分泌缺陷及其生物作用受损，导致眼、肾、心脏和血管等多种组织和器官的慢性损害和功能障碍。研究表明糖尿病患者体内的双歧杆菌数量明显减少[44]，且与高密度脂蛋白胆固醇呈正相关。当双歧杆菌数量恢复正常时，体内炎症因子也相应减少[45]。对I型糖尿病小鼠灌胃青春双歧杆菌后，发现小鼠胰岛细胞的超微结构得到保护，γ干扰素的水平降低，实验表明双歧杆菌能预防和延缓I型糖尿病症状。双歧杆菌对II型糖尿病大鼠胰岛细胞也有同样的保护作用[30,31]。二肽基肽酶4抑制剂(DPP-4抑制剂)是目前糖尿病治疗的常见药物。双歧杆菌IF3-211和双歧杆菌IF1-11也具有DPP-4类似的抑制性能[46]，能够抑制胰高血糖素和促进胰岛素的分泌。α-葡萄糖苷酶是水解碳水化合物、生成葡萄糖的关键酶, RAMCHANDRAN等[32]发现双歧杆菌能抑制其活性来防止血糖的升高。

4 问题与展望

尽管双歧杆菌的分离、筛选和鉴定技术方法成熟，但样品来源比较单一，多为粪便和乳制品，可尽量扩大样品的种类来源和地域范围，提高双歧杆菌多样性。利用宏基因组和单细胞测序等技术，加强对难培养或目前不可培养的双歧杆菌研究，解决其难培养或不可培养的机制，提升我们对双歧杆菌的认识。众多研究表明双歧杆菌具有促进肠道健康、调节“三高”和提高免疫力等生理功能，但研究热点多集中在双歧杆菌细胞壁、肠病治疗和细胞因子等方面，多数以小鼠模型展开研究，其结果与临床应用尚有较大的差距。关于双歧杆菌和人体细胞、癌细胞、或病原菌具体作用机制的研究较少，特别是不同生理功能之间是否存在网络互作还需进一步探索。随着我们加深对双歧杆菌生理功能和作用机制的研究，必将推动双歧杆菌的资源利用和产业开发。