长双歧杆菌DD98体内外安全性评价

时间：2024-07-28

庄伟清，李忠磊，张旭东，陈代杰，谭俊*

1. 上海医药工业研究院，上海 201203； 2. 上海交通大学药学院，上海 200240

益生菌是一种活的微生物，当摄入达到一定量时能够对宿主起到促进健康的作用[1]，其中大部分是乳酸菌，包括乳杆菌、乳球菌和双歧杆菌等至少23个属。近些年来，大量的研究表明益生菌在调节机体免疫系统方面有很多重要的功能，另有研究[2-5]发现益生菌能够改善腹泻，改善炎症性肠病，改善胃肠道功能和抗过敏等。目前益生菌已被应用于发酵乳制品及许多功能性食品中，被认为是有益且安全的，深受消费者的青睐。尽管益生菌受到一致好评，但是潜在的安全问题是不容忽视的[6,7]，随着益生菌市场规模的不断扩大，尤其是在食品和医药等领域，根据新思界产业研究发布的《2016年—2019年中国乳酸菌市场深度分析报告》显示，2015年我国乳酸菌市场的规模已经达到 660亿元，益生菌的安全性评价变得更加重要[8,9]。

对于将作为益生菌使用的乳酸菌，参照世界卫生组织(WHO)、联合国粮食及农业组织(FAO)和欧盟制定的益生菌安全性评估指南[10-13]，需从传统的生理生化检测、体外致病基因检测、抗生素抗性实验和细菌易位实验、体内致病性检测等方面判断其安全性。乳酸菌一般被认为是对人体无害的，但是随着抗生素药物的滥用，新型乳酸菌的分离应用和转基因乳酸菌的出现，乳酸菌的安全性值得关注，特别是投入到实际应用之前。开展乳酸菌菌种安全性评价，是保证最终产品的食用安全，也是保护消费者健康的重要措施[14-16]。因此，本文对具有调节肠道菌群作用的长双歧杆菌DD98进行安全性评价，包括急性毒性实验、耐药性实验及有害代谢产物等实验，以确定其安全性，对开发相应益生菌产品具有一定参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种

长双歧杆菌(Bifidobacteriumlongum)DD98，本实验室专利菌株。

1.1.2培养基

MRS 培养基：蛋白胨 10.0 g /L，牛肉粉 5.0 g/L，酵母粉 4.0 g /L，葡萄糖 20.0 g /L，吐温80 1 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g /L，乙酸钠·3H2O 5.0 g/L，柠檬酸三铵2.0 g/L， MgSO4·7H2O 0.2 g /L，MnSO4·4H2O 0.05 g /L，琼脂粉 15.0 g /L，pH 6.2；115 ℃灭菌20 min。

斜面固体培养基：蛋白胨 3.0 g /L，酵母粉 12.5 g /L，葡萄糖 6.0 g /L，氯化钠 5.0 g /L，无水乙酸钠 3.0 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐 0.55 g /L，琼脂粉 18.0 g /L，pH 6.8，121 ℃灭菌 20 min。种子培养基：即斜面固体培养基去掉琼脂。

发酵培养基：脱脂奶粉 80.0 g /L，酵母粉 5.0 g /L，碳酸钠 3.8 g /L，pH 6.8，115 ℃高压灭菌 20 min。

脱羧酶培养基：胰蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，牛肉膏5.0 g，氯化钠2.5 g，葡萄糖0.5 g，吐温80 1 g，MnSO40.5 g，MgSO40.2 g，FeSO40.04 g，硫胺素0.01 g，K2HPO42g，CaCO30.1 g，溴甲酚0.06 g，5-磷酸吡哆醛0.05 g，前体氨基酸5.0 g，加去离子水至1 L，调pH至5.3～5.5，115 ℃灭菌20 min。

硝酸盐培养基：蛋白胨5.0 g /L，硝酸钾 1.0 g /L，pH 7.0。购置青岛海博生物科技有限公司，产品编号：HB8460。

1.1.3实验动物

健康雄性 SPF 级 ICR 小鼠，6～8 周龄，质量 18±2 g，由上海杰思捷实验动物有限公司提供。饲养于上海交通大学实验动物中心，动物实验计划通过上海交通大学实验动物管理委员会审核。

1.1.4仪器

超低温冰箱FermoTM900，美国Thermo Scientific；超净工作台ZHJH-C1112B，上海智城分析仪器公司；立式高压灭菌锅LDZX-75KBS，上海申安医疗器械厂；BIOTECH-7BG发酵系统，上海保兴生物设备工程有限公司；酶标仪Multiskan Go，美国Thermo Scientific；CA-500 血液自动分析仪，山东兰桥医学科技有限公司； Bio-Rad 荧光定量 PCR 仪，伯乐生命医学产品有限公司； Nano Drop 紫外分光光度计，Thermo scientific 公司。

1.2 方法

1.2.1DD98发酵乳制备

将DD98工作种子接种到新鲜斜面上，于37 ℃厌氧培养箱中厌氧培养24 h；将斜面上的菌苔接种至种子培养基中， 37 ℃厌氧培养箱中培养12 h；将种子按照5 %的接种量接入7 L发酵罐(罐内装6 L发酵乳培养基)，温度37 ℃，转速200 r/min，发酵罐通氮气，发酵过程 pH控制在6.5，待补碱瓶中碱液补完，发酵液 pH 降至5.5时发酵结束，将发酵液灌装至无菌瓶里保存。

1.2.2发酵乳活菌检测

采用平皿浇筑法：选择合适的稀释度菌液，分别取 1 mL 加到无菌平皿里，然后将室温的 BBL 琼脂培养基倒入培养皿中，立即混匀至平板凝固。每个稀释度涂三个平板，37 ℃倒置厌氧培养 24 h 左右，待菌落长好后，计数并计算出原菌液的活菌数(CFU/mL)：每毫升原菌液活菌数=同一稀释度 3个平皿菌落平均数×稀释倍数。

1.2.3抗生素敏感性检测

采用药敏纸片扩散法(K-B法)测定DD98对30种抗生素的敏感性，将待测菌液涂布于MRS固体培养基上，待完全被吸收后，将抗生素纸片放置在上面，37 ℃厌氧培养24 h后测定抑菌圈大小，实验用抗生素标准品由中国食品药品检定研究院出品。本实验委托中国科学院微生物研究所对 DD98菌株进行抗生素敏感检测。

1.2.4急性毒性实验

30 只小鼠随机分为 3 组，每组 10只，一周适应性饲养后，分别灌胃生理盐水、DD98 发酵乳高剂量组(1×1010CFU/mL)、DD98发酵乳低剂量组(1×108CFU/mL)，灌胃剂量为 0.2 mL/只，每天1次，连续灌胃20 d。每天观察小鼠的活动状态，中毒表现，记录体重变化。各组小鼠解剖腹部后，摘取其脏器(心、肝、脾、肺、肾)，用滤纸吸残血，称重，按照公式计算脏器指数[17-19]：脏器指数=各脏器质量(mg)/小鼠体重(g)。整个实验过程中，相关手术操作均严格遵守动物伦理学原则。

1.2.5血常规指标检测

采用阻抗法，在 CA-500 血液自动分析仪上进行血常规检测。共检测 8 种血常规指标，包括白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、血细胞比容(HCT) 、红细胞平均体积(MCV)、红细胞平均血红蛋白含量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)、血小板(PLT)[20, 21]。

1.2.6细菌移位能力评价

HPLC法同时测定蒙药达乌里芯芭中梓醇和益母草苷的含量 ……………………………………………… 包玉秋等（11）：1542

分析小鼠血和脏器组织(心、肝、脾、肺、肾)的细菌移位情况。将50 μL小鼠血涂布于MRS平板，于37 ℃下分别厌氧及有氧培养48 h，计数平板上的菌落数。取组织样品，以1 g/mL悬滴于无菌生理盐水中，匀浆后取100 μL涂布于MRS平板，37℃下分别厌氧及有氧培养48 h，计数平板上的菌落数，有菌落生长即记为阳性。

1.2.7硝酸盐还原酶实验

将DD98菌株接种至硝酸盐培养基中，37 ℃厌氧培养48 h，滴加碘化钾溶液和淀粉溶液，观察颜色变化，以不接种菌液的硝酸盐培养基为空白对照。

1.2.8氨基脱羧酶活性检测

将DD98菌株活化后，分别接入含0.1 %前体氨基酸(赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸)的脱羧酶培养基和未添加前体氨基酸的脱羧酶培养基中，培养2 d～3 d，观察培养基颜色及测定培养基pH[22, 23]。

1.2.9数据分析

实验数据表示为平均值±标准差(mean±SD)，使用 SPSS 21.0 软件统计分析实验数据，并进行相应显著差异分析。

2 结果与分析

2.1 抗生素敏感性实验

表1 抗生素敏感性实验结果

通过DD98对30种常见抗生素的药敏性实验可知，DD98对大部分抗生素具有敏感性，仅对部分抗生素具有抗性：如氨基糖苷类(庆大霉素、奈替米星、阿米卡星)；喹诺酮类(环丙沙星)及磺胺类(复方新诺明)药物。

2.2 有害代谢产物实验

2.2.1硝酸盐还原酶实验

硝酸盐能在硝酸盐还原酶的作用下还原成亚硝酸盐，亚硝酸盐是一种剧毒物质，在胃酸环境下可与食物中的胺类物质形成强致癌物亚硝胺。因此，硝酸盐还原酶实验对菌株的安全性考察非常重要，如果该菌产生硝酸盐还原酶，在硝酸盐培养基上生长时会将硝酸盐还原为亚硝酸盐，此时滴加碘化钾溶液，亚硝酸盐可以从碘化钾中置换出单质碘，再滴加淀粉溶液时会变蓝色[24]。长双歧杆菌DD98在该实验时不能使培养基变蓝色，为阴性反应，说明该菌不产生硝酸盐还原酶，可以在实际生产中应用。

2.2.2氨基脱羧酶活性检测

氨基酸被氨基脱羧酶脱羧后转化成生物胺，过量的生物胺可引起头痛、恶心、呼吸困难、高血压等中毒症状，是非常重要的食品安全性问题，因此，氨基脱羧酶活性检测对菌株的安全性考察非常重要。脱羧酶培养基中，溴甲酚紫的指示范围是pH 5.2～6.8，pH在5.5时呈黄色，稍大于5.5就会呈现紫色或者紫红色。氨基酸脱羧后，会使脱羧酶培养基呈碱性，添加溴甲酚紫指示剂，溶液呈黄色为阴性，紫色则为阳性[25]。长双歧杆菌DD98测定结果为黄色，说明该菌是安全的，可以在实际生产中应用。

2.3 动物实验

2.3.1口服DD98机型毒性实验

灌胃结束的20 d内，小鼠活动正常，饮水饮食无异常，皮毛正常，体重随时间增加，发酵乳组与对照组无显著性差异，说明灌胃DD98发酵乳不会影响小鼠生长。血常规指标可以反映出试验菌株在血液中的副作用，表2结果显示，灌胃DD98发酵乳的小鼠与对照组小鼠的血常规各项指标无显著性差异(P>0.05)，说明服用DD98发酵乳不会对小鼠产生不良反应。

表2 血常规指标(n=10)

2.3.2细菌移位检测

益生菌移位可能引发感染，比如菌血症、败血症或心内膜炎等[26]，因此，细菌移位对菌株的安全性考察非常重要。表3结果表明，对照组与试验组的血和脏器组织(心、肝、脾、肺和肾)经过培养后，培养基上没有菌落生长，表明长双歧杆菌DD98没有从肠道转移到血和脏器组织，为发生移位现象，说明该菌是安全的，可以在实际生产中应用。

表3 被试菌转移到血及脏器组织的移位率