制备过程中添加Triton X-100对细菌纤维素负载纳米氧化锌复合物的影响和抗菌性能的研究

冯 劲， 彭如群， 施庆珊， 谢小保

广东省微生物研究所 广东省科学院 华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东 广州 510070

细菌纤维素(BC)这种来源于细菌的高分子材料，具有一般纤维素的特点同时，还具有许多独特的性质。(1)BC具有极为精致的三维网状结构,正由于这种网状结构，使BC具有很高的结合水能力;(2)BC的微纤维比植物来源的细，因此其表面积要比植物纤维大，具有更高的化学吸附能力;(3)较好的机械性能，其具有高弹性，高回弹性及高拉伸强度[1-3]。 因此BC可用于制备敷料和包装材料。然而，BC并不具有抗菌作用。

纳米金属颗粒已经用于抗菌杀菌剂领域。而纳米氧化锌(ZnO)被认为是低毒的，环保的，较好的生物安全性的和生物相容性[4]。ZnO对广泛的微生物表现出强大的抗菌活性。它们抑制微生物酶，例如脱氢酶，谷胱甘肽还原酶和硫醇过氧化物酶，以显示出显着的抗菌性能[5]。本研究针对BC负载上纳米ZnO，使其具有抗菌性。表面活性剂是两性分子，可降低表面和界面张力。在水溶液中形成球形胶束可以防止纳米颗粒聚集，控制纳米颗粒的大小[6]。因此本研究还探索在制备BC-ZnO过程中添加表面活性剂聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)对细菌纤维素负载纳米氧化锌复合物(BC-ZnO)的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试剂：葡萄糖、醋酸锌、氢氧化钠、Triton X-100等药品均为分析纯。

仪器: 搅拌器、微波化学合成仪、空气摇床、培养箱等。

培养基：SH培养基(g/L)：葡萄糖 20，蛋白胨 5，酵母膏 5，Na2HPO4·12H2O 2.7，柠檬酸 1.5，pH=5.0。

A9培养基(g/L)：葡萄糖 40，酵母膏 1，蛋白胨 7，Na2HPO4·12H2O 8，玉米浆 6，乙酸 1 mL/L，乙醇 14 mL/L，pH=6.0。

NA培养基和沙氏培养基购于广东环凯微生物科技有限公司。

菌株：GluconacetobacterintermediusBC-1细菌纤维素生产菌由本实验室筛选并保藏。大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC8739、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) ATCC6538p和白假丝酵母菌(Candidaalbicans)ATCC10231均由本实验室保藏。

1.2 BC的制备

取一环活化好的斜面菌种BC-1接种入SH培养基中，28 ℃培养振荡培养24 h，摇床转速160 r/min。以10%的接种量接入A9培养基，分装入24孔板中，28 ℃静置培养7 d。取出细菌纤维素凝胶(BC)，去离子水多次冲洗，除去膜表面杂质及残余的培养基。 再将凝胶浸入0.1 mol/L的 NaOH 溶液中，100 ℃水浴至凝胶呈乳白色半透明状。然后用去离子水反复冲洗，使BC pH为7.0。

1.3 BC-ZnO的制备

3.3 g二水合醋酸锌溶于15 mL去离子水中，分别加入Triton X-100 0、0.1、1 mL。将纯化后的BC用吸水纸吸干表面水分后，放入上述溶液中37 ℃振荡。振荡24 h后，取出BC放入50 mL去离子水中，再滴加入50 mL 1 mol/L NaOH溶液，不断搅拌。将上述体系转移入微波反应罐中，微波加热至180 ℃，反应1 h，得到BC-ZnO(体系中加入Triton X-1000、0.1和1 mL，制备得到BC-ZnO分别命名为BC-ZnOT0、BC-ZnOT0.1和BC-ZnOT1)反应后，取出BC-ZnO用去离子水将其冲洗至中性。

1.4 纳米复合材料的表征

采用射线衍射仪(XRD，D/max1200,日本)从2θ为10°记录到95°观察复合物的结构。用0.5 mol/L 硝酸消解BC-ZnO，采用锌测定试剂盒(锌汞比色法)(南京建成生物工程研究所有限公司)测BC-ZnO中Zn的含量。液氮中迅速冷冻结实BC-ZnO，再进行冷冻干燥，采用日立H-3000N 扫描电子显微镜(SEM)观察BC-ZnO中ZnO在BC中的分布。采用液氮中迅速冷冻结实BC-ZnO，立刻研磨。再用无水乙醇重悬分散，采用日立H-7650 透射电子显微镜(TEM)观察BC-ZnO中ZnO粒径大小。利用Image J测量电镜图中100个以上的ZnO微粒，以较长的直径为统计对象，并统计出其粒径分布情况。

1.5 抗菌性能测试

将BC-ZnO在80 ℃烘干，裁剪出直径约为6 mm的小圆片。分别制作含106CFU/mL 的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的NA平板和含106CFU/mL 的白假丝酵母菌的沙氏平板，将BC-ZnO的小圆片贴在平板上，置于37 ℃培养24 h。观察是否有抑菌圈，同时用游标卡尺测量抑菌圈的直径。

2 结果

2.1 物相分析

2.1.1XRD表征

用X射线衍射(XRD)分析样本的化学结构。图1为BC-ZnOT0、BC-ZnOT0.1和BC-ZnOT1的XRD图。发现它们都在22.69o、31.75o、34.44o、36.25o、47.54o、56.55o、62.87o、66.39o、67.92o、69.06o、72.61o、76.96o、81.41o、89.63o和92.77o出现特征峰。其中2θ=22.69o为纤维素的特征峰[7]。而31.75o、34.44o、36.25o、47.54o、56.55o、62.87o、66.39o、67.92o、69.06o、72.61o、76.96o、81.41o、89.63o和92.77o为ZnO的特征峰[8]。表明ZnO成功载入纤维素中。也反映出ZnO载入BC中与Triton X-100的添加无关。

(a) BC-ZnOT0，(b) BC-ZnOT0.1，(c)BC-ZnOT1图1 BC-ZnO的X光衍射图

2.1.2ZnO的含量

添加不同浓度Triton X-100制备所得BC-ZnO中ZnO的含量见表1。大量的ZnO被载入BC中，BC-ZnO中的ZnO的含量都大于50%。发现随着Triton X-100添加量的增加，负载的ZnO的量越多。

表1 添加不同浓度Triton X-100制备所得BC-ZnO中ZnO的含量

2.2 形貌分析

2.2.1SEM

通过扫描电子显微镜观察BC-ZnO的微观结构(图2)。发现BC在碱性环境下经过微波高温反应，依然能保持其三维网状结构，并且纤维丝宽度都小于100 nm。同时发现大量的纳米ZnO都附着在纤维素周围，表明纳米ZnO载入BC中。由图2观察所得，随着Triton X-100添加量的增加，载入BC中的ZnO颗粒团聚越严重。

2.2.2TEM

从TEM图(见图3)中所得纳米ZnO颗粒较均匀分布在纤维素上，但是纳米ZnO的形状不太规则，大部分呈椭圆形。利用Image J测量纳米ZnO大小，每个颗粒较长的直径为统计对象(表2)。BC-ZnOT0中的ZnO平均直径约为59.50 nm，主要分布在40 nm～70 nm区间。BC-ZnOT0.1中的ZnO平均直径约为59.11 nm，主要分布在40 nm～70 nm区间。BC-ZnOT1的ZnO平均直径约为59.11 nm，主要分布在30 nm～50 nm区间。发现随着Triton X-100添加量的增加，载入BC中的ZnO粒径越小。

(a) BC-ZnOT0，(b) BC-ZnOT0.1，(c) BC-ZnOT1
图2 BC-ZnO的扫描电镜图

(a) BC-ZnOT0，(b) BC-ZnOT0.1，(c) BC-ZnOT1，(d) BC-ZnO的粒径分布图
图3 BC-ZnO的透射电镜图和粒径分布图

表2 添加不同浓度Triton X-100制备所得BC-ZnO中ZnO的平均粒径

2.3 材料抗菌性分析

从图4看出，BC-ZnO对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白假丝酵母都有较好的抗菌性能。即说明BC-ZnO对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都有抗菌性。从表3得出，BC-ZnO对革兰氏阳性菌的抗菌效果明显优于革兰氏阴性菌和真菌。并且BC-ZnOT1的抗菌性能好于BC-ZnOT0和BC-ZnOT0.1。说明随着Triton X-100添加量的增加，BC-ZnO抗菌性能越强。

金黄色葡萄球菌

大肠杆菌

白假丝酵母

(a) BC-ZnOT0，(b) BC-ZnOT0.1，(c) BC-ZnOT1
图4 BC-ZnO的抑菌圈

表3 添加不同浓度Triton X-100制备所得BC-ZnO的抑菌圈大小(mm)

3 讨论与结论

添加表面活性剂Triton X-100，使合成得到BC-ZnO中的ZnO的含量提高，并且ZnO的粒径更小。这可能是BC-ZnOT1的抗菌性能好于BC-ZnOT0和BC-ZnOT0.1的原因。也有报道，合成纳米ZnO过程添加表面活性剂使纳米ZnO的形态发生变化，越小的纳米ZnO的抗菌性能也越好[9]。

本研究利用微波合成方法成功制备了纳米ZnO载BC的纳米复合材料。该材料能对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都有抗菌能力。并且对革兰氏阳性菌的抗菌性能优于革兰氏阴性菌和真菌。同时发现，在合成过程中添加表面活性剂Triton X-100能明显影响载入BC中的纳米ZnO。随着Triton X-100添加量的增加，制备所得ZnO的粒径越小，BC负载的ZnO的量越多，BC-ZnO抗菌性能越强。本研究为进一步开发抗菌BC作为外科敷料和食品包装材料奠定基础。