干枸杞浆果菌落总数测定结果的测量不确定度评价

时间：2024-07-28

高阳，刘丹

欧陆食品检测服务(大连)有限公司，辽宁大连 116000

因为食品安全问题引发了一系列的疾病,人们便更加注重食品质量,寻找质检合格的产品才能放心食用。然而食品检验检测中包含了诸多重要指标,但是最常见的检验指标是产品的菌落总数[1]。因为食品在生产、加工和运输途中会受到一定程度的污染，而菌落总数的变化能很好的体现出食品最终质量，成为判断是否符合国家食品标准要求的重要指标。

微生物检测样品具有不均一性，导致多次检测的结果也具有分散性，从而引入了测量不确定度这一概念。在一个完整的测量结果报告中包含不确定度参数，表明结果在一定的置信区间内是真实可靠的[2]。

因此，本文对样品干枸杞浆果的菌落总数测量结果进行了不确定评估，使结果更加准确且完整，具有科学性、真实性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1仪器设备

恒温培养箱：(37±1)℃；恒温水浴锅：(46±1)℃；电子天平：分度值0.1 g；均质器；移液器；无菌培养皿：直径90 mm。

1.1.2培养基与试剂

平板计数琼脂培养基；0.1%蛋白胨盐水(PSS)。

1.2 试验方法

1.2.1菌落总数检测方法

按照国际标准ISO 4833-1:2013 Microbiology of the food chain —Horizontal method for the enumeration of microorganisms —Part 1: Colony count at 30 ℃ by the pour plate technique规定的检测程序进行。

检测过程为：

(1) 无菌称取25 g干枸杞浆果样品并加入225 mL PSS，置于无菌均质袋内均质，用拍打式均质器拍打2 min，充分混合制成10-1初始稀释液。

(2) 用2 mL无菌吸管转移1.0 mL 10-1稀释溶液到9.0 mL无菌PSS，充分混合制得10-2稀释溶液。

(3) 另取一支新的2 mL无菌吸管，重复上述(2)操作，获得进一步稀释，本试验一直稀释到10-5稀释度。每稀释一次即换用1支新的灭菌吸管。

(4) 取两块无菌平皿。用无菌吸管分别吸取 1 mL干枸杞浆果样品的初始悬浮液(10-1稀释度)加到每块平皿中。

(5) 另取两块无菌平皿，用另一支无菌吸管，分别吸取 1 mL 10-2样品稀释液。

(6) 本试验选取后4个连续的十倍稀释液接种到平皿中，以期获得生长菌落数在10～300之间的平皿，以便计数。

(7) 每块平皿倒入12 mL～15 mL冷却到44 ℃～47 ℃的平板计数琼脂，从制备好初始悬浮液(如果是液体样品为10-1稀释液)向平皿内倾倒琼脂，时间不得超过45 min。

(8) 采用顺时针逆时针各三圈、水平和左右方向各三次的方式，将接种液体与琼脂混合均匀，平皿放置在凉的水平面上待凝固。

(9) 完全凝固后，若怀疑产品中的微生物在培养中会蔓延生长至培养基表面时，可需加入4 mL 44 ℃～47 ℃覆盖培养基或平板计数琼脂，覆盖在先前平皿表面，待其凝固[3]。

(10) 将平皿倒置于 (30±1)℃的培养箱中，培养(72±3)h。

(11) 菌落计数：在规定的培养周期后，尽可能记录平皿上菌落低于300的菌落数，乘以稀释倍数报告菌落总数。

1.2.2不确定度的试验方案

由操作人员A和操作人员B分别对10份干枸杞浆果样品进行菌落总数检测试验，试验方案的描述如图1。每个操作人员对每个样品取一次试验的用量，制备初级稀释液进行一次检验检测。具体检测方法按1.2.1菌落总数检测方法进行。

图1 测算实验室内的再现性标准偏差的试验方案

2 结果与讨论

2.1 测量不确定度评定

对两名操作人员同一天检测的10个干枸杞浆果样品菌落总数结果进行归纳分析，详细数据见表1。

再现性标准偏差见式(1-1)

表1 操作员A和操作员B的10个样品计数结果

0.09(log10)CFU/g

(1-1)

式中：

yij——对数转换值，单位为log10(CFU/g)或log10(CFU/mL)；

i——样品的序号，i=1-n(n≥10)；

j——再现性条件的编号，j=A或j=B。

按照《测量不确定度表示导则》(GUM)的定义，扩展不确定度U为合成不确定度uc(y)和包含因子k的乘积。取k值为2(置信水平95%)时，则

U=2uc(y)=2SR

(1-2)

因为再现性标准偏差SR为±0.09(log10)，包含因子为2的扩展不确定度U即为0.09×2=0.18(log10)。

2.2 讨论

2.2.1不确定度来源分析

依据国际标准ISO/TS 19036:2006 Microbiology of food and animal feeding stuffs Guidelines for the estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations的要求，本次实验室采用整体法来评估菌落总数的测量不确定度(MU)。此方法是对经过全部检验检测过程后所得的最终试验结果的可再现性计算标准偏差，认为对标准偏差进行的实验性评估等同于合成标准不确定度。整体法一般忽略偏差，采用“黑匣子”系统，指出了在食品微生物检验检测过程中主要的不确定度来源[4]，如图2列出的九种因素。

图2 食品微生物学不确定度主要来源示意图

2.2.2不确定度的应用

微生物检测中本身存在各种影响因素，使检测结果为一个估计值，而不是准确的数值。例如，表1中操作人员A的1号样品结果为510 000 CFU/g，取对数后为5.71(log10)，那么检测结果报告为：(5.71±0.18)log10=5.53 log10～5.89 log10，计算反对数结果为338 844 CFU/g～776 247 CFU/g。结果报告为338 844 CFU/g～776 247 CFU/g显然比只报告为510 000 CFU/g更具有真实性。同理可得出表1中其他样本结果。由此可见，在测量结果中添加不确定度可以提高检测结果的科学性。