曲霉(霉菌)蛋白酶早期研究的回顾

胡学智

上海市工业微生物研究所，上海 200233

蛋白酶是一用途广泛的生物催化剂，上世纪50年代我国还没有酶制剂工业，唯一的酶制剂只有制药厂少量生产的胰酶和胃蛋白酶，供作医药用的消化剂和制革厂的软化剂，60年代才开始注意微生物蛋白酶的开发利用，例如成都生物制品所之利用霉菌培养物试制蛋白胨，中科院微生物研究所之广泛收集淀粉酶、蛋白酶生产微生物供酿造业使用，中科院上海生化研究所之利用菠萝罐头下脚提取蛋白酶、利用动物废弃胰脏提取蛋白酶等等。

笔者所在研究所前身上海市第一轻工业局试验所发酵组于1959年在顾问陈騊声先生领导下完成了液体曲制酒精研究后，为响应市科委“大打工业生产细菌战”的号召，在进行谷氨酸发酵研究同时，又开展了曲霉蛋白酶的生产与应用研究，自1960到1974年的14年间先后完成了曲霉中性、酸性蛋白酶的生产和工业上应用的研究，囿于当时的环境和水平，我们克服了设备简陋、资料缺乏等困难，通过合理的实验设计和大量的试验工作，终于完成了任务，并成功地工业生产中性和酸性蛋白酶，及开拓出在工业上能广泛应用。

光阴荏苒，转瞬间60年过去了，当年与我共事的同志都已耄耋之年，有的已经离世，笔者也已年逾九旬，趁现在思维尚清，对我们上世纪60～70年代在蛋白酶研究中的峥嵘岁月的片段作一回顾，些许经验供同辈和后进同行参考，也为我国酶制剂工业发展提供点滴史实，不失为有意义之举。

1 栖土曲霉蛋白酶和制革原料皮脱毛

1959年我所前身上海市第一轻工业局试验所发酵组与上海酒精厂、轻工业部食品发酵研究所合作项目“液体曲制酒精的研究”工业化试验成功，在国内首先将抗生素生产的深层发酵技术引进到我国的发酵工业，使酒精工业摆脱繁重的体力劳动，为进一步机械化自动化创造了条件。1964年我所与天厨味精厂、上海生化研究所合作的发酵法生产味精的研究又积极开展，加深了市科委对发酵工业的重视，提出了“工业生产细菌战”的口号，我们为响应工业细菌战的号召，又展开了蛋白酶生产和工业利用的研究，首先对由全国收集到的40余株酿造用曲霉作了普查，用麸皮原料做成麸曲，用水抽提后，分别在中性pH 7.0和酸性pH 4.0的环境下，用明胶甲醛滴定法测定它们的明胶分解力，结果表明黄绿色的曲霉在中性pH具有较强的蛋白质分解力，但在pH 4.0的酸性下无蛋白酶活性或活性甚微，若将浸出液在pH 3.0、40 ℃处理10 min，则中性下的酶活全部消失，只剩下在酸性的微弱酶活，而黑色曲霉则相反，在中性pH毫无蛋白酶活性，而只有在pH 4.0的酸性环境才有较强的蛋白酶活性，虽经pH 3.0处理也无损于蛋白酶的活性，然而若经pH 7.0的环境下40 ℃处理10 min则酶活力完全消失，此结果否定了当时应轻工业部邀请来华的苏联酶学专家芬尼克莎娃院士所作酶制剂的学术报告中宣称“黑曲霉不产蛋白酶”的结论，我们推测她是按常规，是在中性的pH下进行测定所致，此结果加强了我们可用黑曲霉生产耐酸性蛋白酶的信心，其实日本已有从黑曲霉研制酸性蛋白酶的报导了。

皮革生产的第一步是将原料皮用水浸软，在肉面涂抹硫化物石灰浆，使毛囊破坏而脱毛，再人工铲毛，这种工艺劳动强度高，污水严重，既污染环境，更损害工人健康，我们应制革行业要求，试图利用蛋白酶来破坏毛囊使之脱毛，而改善生产面貌，我们打破常规，采用将皮革原料样品直接投入各种菌株麸曲抽提液中，保温振荡来筛选适合脱毛的蛋白酶生产菌种的方法，很快就筛选出了适用的蛋白酶生产菌——栖土曲霉3.374，此菌为中科院微生物研究所之保藏菌种，乃由上海酒精厂制成麸曲后交制革厂试用，很快酶法脱毛在上海和华东地区迅速推广，在上海市7 000人大会受到了市领导的表扬，也引起了轻工业部的注意，酶脱毛新工艺于是在全国推广，由于固体培养方法简单可土法上马，在一些偏远地区甚至连小学、小酒坊也办起了土法生产蛋白酶，来供应当地制革厂的需要。此外，我们还协助上海肉类加工厂、上海鱼品加工厂等将麸曲蛋白酶用于蛋白胨、蛋白、口服水解蛋白及硫酸软骨素等制造以代替供应紧张的胰酶，还用于塑料笔杆厂的废胶卷片基三醋酸纤维和银粒的回收。在此基础上我们又展开了液体深层培养生产蛋白酶的研究，在中科院微生物研究所的支持下，对该所提供的栖土曲霉突变株3.942的液体深层培养生产蛋白酶开展了深入的研究，我们发现，向培养基添加洗净剂LS等表面活性剂，可以不用玉米、黄豆粉等粮食原料，而只用麸皮、米糠、玉米浆等农副产物为原料，来生产蛋白酶，取得通风量要比原来降低到1/3，产酶量增加60%的效果，为低成本工业化生产奠定了基础，与温州味精厂协作进行生产性扩大试验，在半年多时间内，克服了种种困难终于试生产成功，国内生产的真菌中性蛋白酶终于上市供应全国有关行业的应用，促进了许多行业的发展，此成果受到浙江省领导的重视，并被列为浙省重第二重大科研成果，当时筹款40多万元，新建温州发酵化工厂进行生产。

在温州味精厂进行中试是异常艰辛和难以想象的，这个厂是由粉丝作坊等组合而成，工人文化程度低，更缺乏微生物方面的知识，要其掌握先进的深层发酵技术难度可想而知，该厂厂长王峰同志是位复员军人，在他领导下办起了味精厂，我们厂所密切合作在试制过程中好不容易解决了染菌，又遇到原料缺货，如过滤用的助滤剂硅藻土缺货，我们只得自己动手做，将建筑用硅藻土在食堂厨房铁锅中焙炒去除有机质，在大于200 ℃的高温下铲刀柄都烤焦了，工人眉毛也烤黄了，就这样制出了合用的助滤剂。又如盐析用硫铵也因供应不继得自己解决，我们只得从盐析废母液浓缩后回收才解决问题，像这样的问题层出不穷，我们就是在这样条件下来完成试验任务的。1968年11月，在浙江省科委主持下对栖土曲霉3.942蛋白酶进行了全国鉴定，浙江日报作为重大新闻大幅报导。不久上海轻工业局也筹建了佳乐酶制剂厂，令我们前去协助生产该蛋白酶。

2 酸性蛋白酶的研究

毛皮是北方人冬季御寒的主要用品，毛皮生产的传统制法是米硝法，将米面抹在毛皮上任其自然发酵，使皮胶元的间隙蛋白质分解而变得松软，但这种工艺制成的皮有异臭，毛皮不可水洗，含灰量高，穿着笨重，生产耗费粮食，为此新疆建设兵团要求我所对采用酶法软化毛皮进行研究，以应中国人民解放军总后部提出“减轻战士装备重量一公斤”的号召，我们先同上海皮张厂协作，试用胰酶和栖土曲霉蛋白酶来软化毛皮取得成功，成品毛皮轻薄软暖，还可水洗，又大大节约粮食，此技术受到了第二轻工业部、外贸部和全国合作总社的重视，成立了三部联合领导小组来推广酶法软化毛皮新技术，1974年专门邀请我们去张家口全国软化毛皮新工艺学习班讲授蛋白酶有关知识(胡学智、王恩荣同去)，因酸性蛋白酶可在酸性环境下发挥作用，无中性蛋白酶之缺点，细菌不易繁殖，不会引起烂皮、掉毛等事故，且软化浴可反复使用多次，节省成本故更为适用。

为此我们集中精力开展了酸性蛋白酶的研究，那时尚没有可以省工省时的优选法，更没有现代的高通量筛选技术，要取得成功全靠成百上千甚至上万个摇瓶培养收集测定数据才行，工作量之大现在是难以想象的。

我们对100多株黑曲霉，每个菌株采用固体培养、液体培养同时并举的方法，液体培养每个菌株同时用四种配方培养基来筛选菌种以避免优良菌株之漏筛。最后筛选得到黑曲霉3.350，宇佐美曲霉白色变株(即537的母株)以及玉桂色曲霉No.81的酶活性最强。

我们对黑曲霉3.350培养条件优化以后乃同上海酒精厂合作进行发酵罐放大试验，为便于查找发酵罐发酵发生的异常情况，我们套用了在谷氨酸发酵研究中摸索出来的一套罐对照试验方法，将实验室配制的培养基和发酵罐灭菌后的培养基分装三角瓶，接种试管菌种后摇瓶培养来观察发酵罐培养基有何问题，将实验室配制之培养基分别接种试管菌种和种子罐种子作摇瓶试验以检验种子罐培养有无问题等，试验一式三份，故每上罐一次摇瓶对照样品就一大堆，工作量很大。

在5 000 L发酵罐发酵时，一连几个月发酵很不正常时或不长菌，时或产酶很少，查遍菌种、原料和罐对照摇瓶都无问题，令人费解，也遭到了厂方质疑，怀疑菌种、怀疑科研不成熟等等，压力很大。作者只得从发酵罐去找原因，乃亲自钻入发酵罐检查，发现在紫铜冷却盘管有一层蓝绿色污垢，凭着大学中学到的定性化学分析知识，意识到这是一种铜氨复离子，是由培养基中铵离子与铜结合生成的络合物，因为我们所用培养基中含大量的氯化铵作无机氮源，而铵离子对铜有腐蚀性，乃生成了铜氨复离子从而对菌体造成毒害，于是将此判断反映给厂领导，建议将铜管换热器改成不锈钢的，起初厂方不信，我们只得将铜管铜片按发酵罐中冷却管与发酵液接触面积之比例剪取小块铜片放入摇瓶培养基中作摇瓶试验来验证。结果表明，加有铜片的一组菌体生长不佳产酶甚少，而对照组不加铜片的一切正常，这一措施终于获得了厂领导的信服，花4千多元钱改换了冷却管，再次投料试验，一举成功，一连试验45罐平均产酶活性2 500 U/mL，最高3 000 U/mL，圆满完成了酸性蛋白酶的试生产任务，我国酸性蛋白酶终于工业生产成功，填补了我国酶制剂工业的一个空白。

此外我们又同上海医药工业研究院协作，将酸性蛋白酶盐析粗品离交脱盐纯化冷冻干燥后作成肠溶片，在上海十家医院(包括中山医院、第六人民医院、第二人民医院、龙华医院、曙光医院、市劳动卫生研究所等中西医院及四家地段医院)的支持下，历时二年多对700多名内外科患者进行临床试验[9]，结果表明酸性蛋白酶对于呼吸道疾病、外科血栓性静脉炎、术后血肿水肿粘连等均有良好效果，用于慢性支气管炎的有效率达80%，且兼具平喘效果，药用酸性蛋白酶受到医院和患者的欢迎，但因不久国家有文件规定非医药企业不得从事药品生产，药用酸性蛋白酶终于未能正式生产造福患者，殊为可惜。

近年由不同菌株生产的酸性蛋白酶已被广泛用作饲料添加剂，用于粮食酒精发酵、酒、酱、醋等发酵制品的生产，对提高饲养效率，减少动物疾病，提高发酵品得率与品质发挥了明显的经济效益。

3 关于蛋白酶活性剂测定出现的问题

蛋白酶是一类复杂的酶，专一性极强，对其切开的肽键氨基酸组成有着严格的选择性，水解肽键的能力还受到肽键长度、切开点前后肽键氨基酸组成的影响，不同来源蛋白酶水解同一蛋白质的能力不同，同一蛋白酶水解不同蛋白质的能力也不同，故采用不同的蛋白酶测定方法，能反映蛋白酶对不同蛋白质底物的水解行为。上世纪50年代我国还没有酶制剂工业，也没有测定蛋白酶的标准方法，其时国外已发展了不少测定蛋白酶活性的方法，例如明胶液化法、明胶粘度下降法、明胶甲醛滴定法、酪蛋白血红蛋白沉淀法、275 nm紫外分光光度法、Folin试剂显色法，以及Gross-Fold法、DHT酪蛋白测定法等等。由于Folin试剂显色法灵敏度高，即使微弱的蛋白酶活性也可以显示出来，因此我们在国内首先选用了Folin试剂比色法来测定蛋白酶活性，那时光电比色计已算是很高级的仪器了，而Folin试剂得自己来合成，此法在国内推广后，经中国发酵协会验证后，申报国家标准局列为国家标准法。其实此法还存在一些问题尚待解决。我们在酸性蛋白酶研究时，用Folin法测定金属离子对酶活性的影响，发现向酶液添加终浓度2×10-3mol/L的铜、锰、铝等金属离子时，可明显提高酸性蛋白酶的活性，尤其这三者同时添加时，酶活性可增强三倍(表1)，因而得出Cu2+、Mn2+、Al3+可激活酸性蛋白酶活性的结论，并发表在《微生物学报》[1976,16(3):220-223]和作者参与编写的《酶制剂工业》、《酶制剂生产技术》等书中，40多年来被广泛引用，但在2005年笔者等利用宇佐美曲霉酸性蛋白酶试制高效酒精发酵剂时，试图向酶粉添加铜离子等来增强蛋白酶活性，同一样品同时用紫外分光光度法测定法与Folin法测定酶活性，却发现用紫外分光光度法测定280 nm吸光值的方法，Cu2+、Mn2+等对酶活性非但无激活作用反而有轻度的抑制。虽然Folin法测定对这些金属离子对酶活性仍呈明显的促进作用(表2)。令人百思不解，查遍有关文献终于在日本酶学泰斗赤崛四郎1950年所著巨著《酵素研究法》第二卷蛋白酶一章中得到启发，他说“Folin法与紫外分光法相比，灵敏度高，尤其加有铜的Folin试剂灵敏度更高，适合于微量蛋白酶的检测，与之相反，紫外分光275 nm吸收法，不受加铜的影响”，可见铜离子的存在可引起酪氨酸与Folin试剂的蓝色反应增强而造成铜离子可增强蛋白酶活性之假像，以致造成误导，为此将此发现发表在《江苏调味剂食品杂志》，但未受到有关人员的注意，陆续有人在其文章中仍谈到铜等金属离子对酸性蛋白酶呈激活作用。令人费解的是我们在1967年进行栖土曲霉蛋白酶研究时，同样是用Folin法来测定金属元素对酶活性的影响的，却并未发现铜离子对中性蛋白酶的激活作用(表3)，唯一的区别是酸性蛋白酶是在酸性环境下作保温处理，

表1 金属离子对酸性蛋白酶活性的激活作用*

表2 金属离子对宇佐美曲霉酸性蛋白酶活性影响*

表3 金属离子对栖土曲霉中性蛋白酶的影响*

而中性蛋白酶是在中性环境下处理的，除此无法解释，这恐怕还有待于今后学者去探明了。

4 后记

上世纪60年代我国科技界为贯彻科研14条，通过批判“知识私有”、“技术垄断”、“名利思想”等资产阶级思想，提倡共产主义风格，我们与大家一样，对科研上的有所发现、有所心得以及一些know how都会无保留地与同行共享，甚至连原始记录也会公开给前来学习取经的同志参阅，唯恐对方不掌握。技术交流会、技术鉴定会、主办方都能把技术无保留地与大家交流，使与会者深为受益，当时的研究论文报告都能翔实记叙研究过程的细节，可以照搬重复出来，因之国内有些科研内容时有雷同而水平也相仿。

在谷氨酸发酵研究中，北大钱存柔教授将其分离得到的谷氨酸杆菌29906无私地供给我们研究，中科院上海生化所的周光宇先生将其国外学习带回的栓压法测定谷氨酸和纸层析、电泳等新技术无私传授给我们，上海植物生理研究所焦瑞身先生将其从国外带回的黑曲霉337与330提供给我们研究，使液体曲制酒精得以迅速完成，上海医药工业研究院童村院长将其抗生素发酵摸索得出的一套染菌防治措施无保留地传授给我们，解决了谷氨酸发酵罐经常染菌的问题，在葡萄糖异构酶的研究中，江苏化工研究所将其链霉菌生产异构酶的资料、固定化技术连同菌种毫无保留提供我们作进一步的研究，同样我们也将自己的研究心得无保留地奉献给前来取经学习的同行，例如蘑菇菌丝体深层培养技术，国内外首创的用蘑菇深层培养菌丝体作农业栽培种的方法，以及经过千百次试验成功的糖蜜原料发酵生产谷氨酸的研究都无保留地传授给前来学习的同行，使这些技术得以在外地推广应用。在谷氨酸发酵研究中，周光宇先生提供的利用谷氨酸脱羧酶栓压法测定谷氨酸的方法在全国味精行业获得推广，但因老方法制取的脱羧酶活性不高反应时间长，影响工作效率，我们通过研究，向培养基添加含有脱羧酶辅酶维生素B6的酵母，使大肠杆菌脱羧酶总活性增加了5倍，反应时间由24 min缩短到6 min～7 min，大大提高了工作效率和正确性，我们主动将这一研究结果油印后寄发全国味精厂和科研大专院校交流共享，像这样将研究成果无保留给兄弟单位参考的事在当年是很平常的事。当时，发表研究论文，为避免名利思想之嫌大多以单位名义发表，若合作方是工厂企业，则署名时将工厂企业列在前，而科研设计单位列于后。80年代改革开放以来，为了促进竞争，实现了专利制，加强了保密观念，技术成果实行有偿转让，一段时间甚至有些技术交流咨询也实行起按时计费等等，一些研究报告、技术鉴定资料、论文和技术总结也语焉不详，只起到自我推介广告的作用。因此，如何做到既保密又实用而且有学术交流价值，是值得研究的。