沙门菌PrgH蛋白的生物信息学分析及其单克隆抗体制备

李 杰， 张闻桐， 黄志强， 刘 涛， 刘 箐

上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093

沙门菌(Salmonella)属革兰氏阴性肠杆菌科，是最早由美国细菌学家Salmon与Smith于1885年发现[1]的一种常见人畜共患病原菌[2]。目前已发现有2 500多个血清型[3]，包括肠道沙门菌和邦戈尔沙门菌两个种，肠道沙门菌又可分为6个亚种：肠道亚种(S.entericasubsp.enterica)、萨拉姆亚种(S.entericasubsp.salamae)、亚利桑那亚种(S.entericasubsp.arizonae)、双相亚利桑那沙门菌(S.entericasubsp.diarizonae)、豪顿沙门菌(S.entericasubsp.houtenae)和印度沙门菌(S.entericasubsp.indica)。沙门菌能引起禽伤寒、鸡白痢、猪霍乱等动物性疾病，以及人类胃肠炎、类伤寒、败血症、感冒等感染型食物中毒。据估计，每年有超过19万人死于伤寒、甲型、乙型和丙型副伤寒沙门菌[4]，沙门菌感染是威胁人类健康和全球经济发展的重大疾病[5,6]。

III型分泌系统(Type III secretion systems，T3SSs)是一个多组分蛋白复合体组成的跨膜通道，通过分泌毒力蛋白后直接注入宿主细胞发挥致病作用，是仅存在于致病性革兰氏阴性菌如沙氏菌、铜绿假单胞菌[7]、耶尔森鼠疫杆菌及志贺菌等[8]的蛋白分泌系统，通常被称为T3SS注射装置(injectisome)[9]，用于将毒力蛋白(效应蛋白)像注射器一样直接注射到宿主细胞以达到侵入并致病的目的[10,11]。在与宿主细胞接触后，沙门菌T3SSs被激活并分泌的效应蛋白与宿主细胞相互作用，在沙门菌入侵肠道上皮细胞的感染过程中起重要作用[12]，也是在吞噬细胞中存活并引起沙门菌的全身性感染所必需[13]。HU B等[14]通过高通量的低温电子断层扫描和亚单位平均技术，原位确定了沙门菌III型分泌机制的完整结构，包括细菌胞外成分、横跨细胞膜的基体、胞内成分和分子伴侣等四大类，其中主要结构单元基体主要由三种蛋白质组成，他们排列成一系列高度低聚的同心环：包括内膜环(PrgH/PrgK)、输出装置、外膜环(InvG)等结构[15]。当T3SS与宿主细胞接触后，注射装置被激活，开始于基座的组装,随后是针及内杆的组装,终止于针组装的完成[16]。T3SS这一复杂的分子装置中，某一蛋白的功能被破坏都可能威胁到整个系统的功能活性, 因此沙门菌T3SS是重要的药物靶点[17]。

PrgH是具有脂蛋白的结构修饰单元[18]，分泌后被派送到基体内膜上，低聚合为24个拷贝的稳定外环结构[19]，对T3SS结构的稳定性和功能活性至关重要。我们运用生物信息学手段分析PrgH的理化及结构特性,对不同血清型的沙门菌进行特异性基因prgH的PCR鉴定及关系进化树分析其蛋白保守性,以融合表达的PrgH蛋白作为免疫原制备了兔多克隆抗体及鼠源单克隆抗体，验证PrgH的免疫原性。本研究对PrgH蛋白理化及结构特性的分析有助于进一步的了解沙门菌T3SS的结构组成及致病机制；本实验中制备的针对T3SS结构蛋白PrgH中和抗体较真实的反映PrgH较高的免疫原性，为沙门菌药物靶点的筛选提供参考，同时制得的多克隆抗体及单克隆抗体抗体或为T3SS抑制剂的ELISA筛选系统提供材料和思路。

1 材料与方法

1.1 材料

(1) 实验菌株、细胞与动物：研究涉及的标准致病菌菌株包括27株沙门氏菌(表1)及原核表达质粒pET-30(a)为本实验室保存，原核表达工程菌E.coilDH5α，E.coilBL21购买自天根生物技术有限公司，所有菌株均用LB培养基37 ℃培养；SP2/0小鼠骨髓瘤细胞由上海理工大学有害微生物危害与控制研究所保存；6～8周龄SPF级Balb/c雌性小鼠购买自中国上海杰斯捷实验动物有限公司。2.5 kg雄性6月龄新西兰白兔由第二军医大学实验动物中心提供。

(2) 试剂与耗材：一步克隆试剂盒(OneStep Cloning Kit)购自南京诺唯赞生物科技有限公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside, IPTG)一步法细菌活性蛋白提取试剂盒(One Step BacterialActive Protein Extraction Kit)和 His 标签纯化柱(Ni-IDA-Sefinose Column)购自生工生物工程(上海)股份有限公司；琼脂糖割胶回收试剂盒(BioSpin GelExtraction Kit)和质粒抽提试剂盒(BioSpin PlasmidDNA Extraction Kit)购自杭州博日科技生物有限责任公司；DMEM高糖细胞培养基购自GIBCO公司；辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)标记的山羊抗兔二抗、辣根过氧化物酶(horse reddish peroxidase，HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体购自美国Sigma公司；胎牛血清购自BIOSUN公司。

表1 实验涉及菌株及编号

1.2 方法

1.2.1PrgH的生物信息学分析

从综合性数据库NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed )中检索prgH的基因序列(Gene ID: 1254397)。PrgH蛋白(P41783)氨基酸序列来自蛋白数据库Uniprot(http://www.uniprot.org/)。PrgH蛋白的三维结构信息来自结构数据库RCSB-PDB(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)，并在数据库中对蛋白的一级，二级，三级结构进行分析。运行ExPASy 的ProtParam[20](https://web.expasy.org/protparam/)程序分析预测PrgH 的理化性质。运行SignalP 5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序预测PrgH是否含有信号肽及其剪切位点。运用跨膜分析软件TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)及二级结构预测软件PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)预测PrgH是否为膜上蛋白及其跨膜区域跨膜。运用分子三维结构分析软件Pymol对PrgH三维结构进行展示与分析。

1.2.2引物设计与合成

鼠伤寒沙门氏菌SalmonellaentericaserotypeTyphimurium LT2 (S. Typhimurium LT2)菌株是研究沙门氏菌的模式菌株，根据NCBI数据库上公布的沙门氏菌LT2菌株上prgH序列(Gene ID：984739)，运用Primer3[21](http://primer3.ut.ee/)设计鉴定引物F1-R1，用于目的基因prgH在实验室保存的沙门菌的广谱性分析。根据一步克隆法要求设计扩增目的片段的引物F2-R2，构建连接目的基因的重组质粒，用于目的基因测序后系统进化树的分析以及蛋白的原核表达。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司成。

1.2.3序列广谱性鉴定及系统进化树构建

为检测目的基因prgH在27株沙门菌的广谱性，用F1-R1以27株沙门菌为模板进行 PCR扩增，通过琼脂糖凝胶电泳(AGE)来分析目的基因prgH的广谱性。用F2-R2扩增27株沙门菌的prgH片段连接至pET30a载体，将构建成功的重组质粒导入大肠杆菌DH5α，阳性菌经扩大培养后抽取质粒，送至上海华大基因科技有限公司进行测序，将测序结果运用MEGA 7.0[22]构建NJ(Neighbor-joining)[23]系统进化树，采用p-distance[24]法计算进化距离。

1.2.4PrgH原核表达及纯化

根据进化树结果，以序列同源性最高的沙门菌SalmonellaTyphimurium ATCC 14028为模板对目的片段prgH进行扩增。PCR产物纯化后的目的片段用一步克隆试剂盒重组至质粒pET30a上，将重组质粒pET30a-prgH转化到EcoliDH5α感受态细胞中，50 mg/mL卡那霉素抗性筛选及PCR鉴定为双阳性的菌落，扩大培养后抽提质粒送至上海华大基因科技有限公司进行测序。将测序正确的重组质粒转入表达菌EcoliBL21(DE3)，培养BL21-pET30a-prgH至对数生长期，即OD600 nm为0.6～0.8时加入诱导表达剂0.2 mmol/L IPTG，诱导表达4 h。采用一步法细菌活性蛋白提取试剂盒从EcoliBL21(DE3)中提取可溶性蛋白，之后用8 mol/L尿素处理包涵体，SDS-PAGE鉴定重组蛋白的诱导表达情况。

300 mL LB培养基培养BL21-pET30a-prgH，诱导表达后富集菌体后用10 mL 0.01 M磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液重悬，重悬液于冰浴超声破碎(5 s,10 s,40 min,150 W)，12 000 r/min离心20 min，分离收集上清，沉淀用8 mol/L尿素于37 ℃处理1 h，12 000 r/min离心20 min后留上清即为包涵体蛋白。根据Ni-NTA亲和层析柱试剂盒说明分别对胞质活性表达蛋白及包涵体表达蛋白进行纯化。

1.2.5动物免疫

取5只6～8周龄SPF级 Balb/c雌鼠体重18±2 g左右，耳标编号NO.1～NO.5，对小鼠采用小腿肌肉注射PrgH进行免疫。共免疫3次：第一次为PrgH蛋白与弗氏完全佐剂1∶1混合液，注射剂量为100 μg/只；于第三周及第四周加强免疫2次，将PrgH蛋白于弗氏不完全佐剂1∶1混合，注射剂量为100 μg /只。对6周龄新西兰白兔颈背部皮下多点注射进行免疫，免疫剂量为500 μg/只，首次免疫后第三周、第五周、第六周加强免疫三次。

卡夫卡与父亲关系的奇特之处在于，“A给B一个坦率的、与他的人生观相符的、不太美的、但却是今天在城市里很有普遍意义的、也许能防止健康受损的建议。这个建议对B在道德上没有多大鼓舞力量，但他难道就不能随着岁月的推移逐渐从这种损伤中摆脱出来吗？再说，他并不是非听从这个建议不可的，何况仅仅在这个建议中也看不出促使B的整个未来世界将崩溃的因素。但事情偏偏还是这样发生了，原因仅仅在于；你是这个A，我是这个B”[4]461-501。

1.2.6多克隆抗体制备及其效价测定

新西兰兔免疫前耳缘静脉采血作为阴性对照，最后一次加强免疫一周后心脏采血;室温放置1 h后4 ℃静置过夜，待血清析出后4 000 r/min离心10 min，分离后的血清经饱和硫酸铵沉淀，12 000 r/min离心30 min后获得的沉淀即为PrgH兔多克隆抗体，最后将抗体置于-20 ℃冰箱中保存备用。酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定多克隆抗体与PrgH蛋白以及不同血清型沙门菌的结合情况。具体操作为：30 μg/mL PrgH, 100 μL/孔或者108CFU每孔沙门菌加入96孔板中，4 ℃过夜包板； PBST洗板3次后加入200 μL 3%脱脂乳粉封闭液，37 ℃孵育2 h；洗板后加入100 μL 1∶1 000～1∶2 048 000倍比稀释的PrgH多克隆抗体，37 ℃孵育1 h；洗板后加入100 μL/孔的TMB显色液，37 ℃避光反应15 min；加入50 μL/孔2 mol/mL的浓硫酸终止液后测定450 nm波长处的吸光值。

1.2.7单克隆抗体制备及其效价测定

小鼠三免后一周尾静脉取血，间接ELISA 测定NO.1—NO.5五只小鼠血清中特异性抗体水平，抗体效价最高的小鼠在冲击免疫后三天用于细胞融合。具体操作为：摘眼球取血作为阳性血清，小鼠脱颈处死后取脾细胞，实验中以50% PEG(MW2000)作为促溶剂诱导小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，用含HAT/HT选择性培养基对杂交瘤细胞进行筛选，间接ELISA法测定孔板细胞培养液中抗体的效价确定阳性孔，采用有限稀释法对阳性孔进行单细胞克隆，筛选出稳定产生特异性抗体的单细胞株即为单克隆抗体杂交瘤细胞株。

将筛选的杂交瘤细胞株扩大培养，调整细胞浓度2×106细胞/mL，选取8周龄Balb/c雌性小鼠5只，腹腔注射液体石蜡0.3 mL/只，7 d～14 d后，腹腔注射杂交瘤细胞0.3 mL/只，10 d左右活体抽取腹水，4 ℃、5 000 r/min离心10 min，腹水经饱和硫酸铵沉淀初步纯化后，用Protein-G柱亲和层析进行纯化，SDS-PAGE检验抗体纯化效果。ELISA测定单克隆抗体与PrgH以及不同血清型沙门菌的结合情况并利用抗体亚型试剂盒对单克隆抗体的亚型进行测定。

2 结果与讨论

2.1 PrgH的理化性质

NCBI及Uniprot数据库注释PrgH的基因全长1 179 bp，编码392个氨基酸。经ProtParam软件分析，PrgH相对分子量为44 460，等电点理论值5.73，酸性氨基酸总数(Asp+Glu)为50个，碱性氨基酸总数(Arg+Lys)为45个，不稳定指数为45.55，属不稳定蛋白，在大肠杆菌体内的半衰期大于10 h(原核表达蛋白时间)，脂肪族氨基酸指数为88.57，平均亲水系数为-0.391，为亲水性蛋白。

2.2 PrgH的信号肽分析

SignalP-5.0对PrgH的信号肽预测结果如图1所示，两种常规分泌通路(Sec/SPI)，(Sec/SPII)以及双精氨酸转移通路(Tat/SPI)的信号肽的可能性都小于0.1，表明PrgH中不存在信号肽片段，不是分泌蛋白。

图1 PrgH信号肽预测

2.3 二级结构分析

2.4 三级结构分析

三维结构6duz.pdb是由HU J[25]等利用透射电镜研究所得晶体衍射结构，由PrgH(172-364)与PrgK聚合而成的48聚体，是T3SS高度低聚化的空环结构，其中PrgH为外环，PrgK为外环。经过软件Pymol处理，去掉PrgK结构后展示的PrgH 24聚体环状结构如图3-A所示，共由24条重复单链 A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,K,L,M,N,O,P,Q,R,S,T,U,V,W,X聚合而成，其中图3-B为单链A的三维结构。图3-C为Pymol展示的三维结构3j1w.pdb是BERGERON JR[26]等利用透射电镜研究所得晶体衍射结构，由PrgH(14-119)的24条单链聚合而成，图3-D所示三维结构图为Pymol展示的PrgH(14-119)单链A。

A. PSIPRED预测的PrgH二级结构；B. TMHMM对PrgH跨膜结构分析；C. MEMSAT-SVM预测跨膜螺旋结构
图2 PrgH二级结构分析及跨膜结构预测

2.5 prgH保守性鉴定及进化树构建

(1) 目的基因prgH的鉴定引物为F1-R1，其中上游引物F1序列为：5′-CTGCTTCAGGTCAACTCCCT-3′；下游引物R1：5′-ATAACCTTCCGCCCCGTAC-3′，鉴定目的片段的长度为995 bp。F1-R1引物用于目的基因prgH在实验室现有沙门菌中的覆盖率分析，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析结果如图4所示，prgH在27株沙门菌(菌株编号如表1)中的覆盖率高达100%，且目的片段大小在995 bp左右。

(2) 根据一步克隆法要求设计用于质粒重组的引物F2-R2，其中上游引物F2序列为：5′-GCCATGGCTGATATCGGATCCATGGAAACATCAAAAGAGA-A3′；下游引物R2：5′-GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAAGTGGGCTTGGGAAAT-3′，上下游引物分别引入BamH I和XhoI酶切位点(下划线处)。引物F2-R2用于将26株不同的沙门菌的目的片段prgH重组到质粒pET30a，测序后结果由MEGA7构建NJ进化树进行分析，结果如图5所示，该方法给出了树枝长度和为0.025 365 78的最优进化树，选择Bootstrap consensus tree[27]，系统发生树中绝大多数节点处的数值≥70，反映该进化树的可信度较高。将prgH序列经blastn比对，显示同源性均高于99%，其中目的基因prgH在SalmonellaTyphimurium ATCC 14028与模式菌株SalmonellaTy-phimurium LT2中同源性为100%，故选做蛋白表达的模板菌株。

A. PrgH (172-364) 24聚体三维结构；B. PrgH (172-364) 单链A三维结构；C. PrgH(14-119)24聚体三维结构；D. PrgH(14-119)单链A三维结构，所有结构图均Pymol软件处理并展示

图3 PrgH三维结构图

图4 prgH在27株沙门菌中的PCR鉴定

2.6 原核表达与纯化

重组质粒pET30a-prgH表达蛋白的大小为55 000，SDS-PAGE结果如图6中的泳道8所示，pET30a-BL21-prgH的诱导表达效果明显，在55 000处有明显的蛋白条带，与预期大小一致，因此PrgH在BL21(DE3)菌体内以包涵体的形式成功表达。包涵体表达蛋白用8 mol/L尿素处理并用His标签纯化柱纯化，经6 mol/L、4 mol/L、2 mol/L，PBS梯度复性处理后分装-20 ℃放置备用。

2.7 多克隆抗体效价测定

采用间接ELISA 法测定多克隆抗体效价，OD450 nm值大于阴性对照(Negative control，NC)2.1倍的最高稀释度即为最终效价。由图7-A可知,以PrgH多次免疫后兔血清抗体水平达到较高值，效价可达到1∶1 024 000+，兔血清抗体能与27株沙门菌较好地结合(图7-B)。PrgH具有较高的免疫原性且作为免疫原制备的多克隆抗体能够广泛覆盖实验室现有的27株不同血清型的沙门菌。

2.8 单克隆抗体制备及其特性

NO.1-NO.5五只小鼠三免后一周尾静脉取血，间接ELISA 测定小鼠血清中特异性抗体效价均高达1∶128 000，结果如图8-A所示，取NO.5号小鼠加强免疫后进行细胞融合，筛得两株能够稳定产生特异性抗体的杂交瘤细胞，经亲和层析柱纯化后所得单克隆抗体命名为4G7，4E2。如图8-B所示，分别有一条55 000左右的重链和26 000左右的轻链，且抗体纯化效果较好。间接ELISA测定抗体亚型发现两株单克隆抗体均为IgG2b，抗体效价测定结果如图8-C，8-D所示，4G7，4E2效价分别为1∶2 048 000+，1∶1 024 000，均具有较强的亲和力。

图5 PrgH关系进化树

Maker：180KD；1：pET30a-BL21未诱导表达胞质蛋白；2：pET30a-BL21诱导表达胞质蛋白；3：pET30a-BL21-prgH未诱导表达胞质蛋白；4：pET30a-BL21-prgH诱导表达胞质蛋白；5：pET30a-BL21未诱导表达包涵体蛋白；6：pET30a-BL21诱导表达包涵体蛋白；7：pET30a-BL21-prgH未诱导表达包涵体蛋白；8：pET30a-BL21-prgH诱导表达包涵体蛋白。

图6 PrgH诱导表达及鉴定

A. PrgH兔多抗血清与PrgH结合情况；B. PrgH免疫兔多抗血清与沙门菌结合情况图7 PrgH免疫兔多抗血清抗体滴度的ELISA测定

3 结论

应用生物信息学工具对沙门菌T3SS的核心结构蛋白PrgH蛋白的理化性质，二级、三级结构以及跨膜区域进行了比较系统的分析，结果表明PrgH是一种单次跨膜、亲水性的不稳定蛋白，无分泌信号肽，在T3SSs中以24条单链高度低聚为稳定的空环结构存在。prgH在沙门菌中的PCR鉴定显示，目的基因在27株不同血清型沙门菌的覆盖率为100%。26株沙门菌中目的片段测序后建立了可信度高的关系进化树，目的基因在的blastn比对结果显示同源性高达98%，prgH在沙门菌中高度保守。融合表达并纯化后的PrgH蛋白进行动物免疫，制得的兔多克隆抗体效价高达1∶1 024 000+，且能与27株沙门菌较好的结合。筛得两株单克隆抗体4E2，4G7，效价分别为1∶1 024 000，1∶2 048 000+，均能与目的蛋白发生特异性抗原抗体反应，证明PrgH具有较高的免疫原性。

现有针对沙门菌感染的主要治疗方案仍然是抗生素[28]，但是随着抗生素的滥用，细菌耐药性成为日益严重的问题[29，30]，更多抑菌药物及疫苗的开发至关重要。T3SS在沙门菌致病方面起到重要的作用，而且结构成分蛋白高度保守，是开发抗菌药物有效靶标。PrgH作为T3SS的主要结构蛋白，在T3SS的结构模型完整性以及毒力因子的高效转运中起到至关重要的作用，对PrgH进行结构，功能及免疫原性分析以及制备的单克隆抗体或可为沙门菌药物靶标的筛选提供理论及实验基础。本实验有助于针对沙门菌设计合理的预防及治疗策略，研发新的沙门菌检测方法及治疗药物，将对沙门菌感染的预防和控制有着重要的意义[31]。

A.五只小鼠3免后效价测定；B.抗体4G7,4E2纯化效果；C.抗体4G7效价测定；D.抗体4E2效价测定图8 单克隆抗体及其效价