土霉素生产优良菌株的筛选与发酵条件优化

王子竹， 王红英， 刘进文， 尹丽景， 钱斯日古楞*

1.大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034；2.内蒙古华曙生物科技有限公司，内蒙古 通辽 028400

土霉素(Oxytetracycline，OTC)又称地霉素、氧四环素和5-羟基四环素，是一种化合物(分子式为C22H24N2O9)，其相对分子质量为460.44。土霉素为淡黄色晶体，酸碱的两性分子，微溶于水。土霉素具有广谱抗菌作用，对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有较好的抑制生长效果。土霉素的抗菌机制主要是通过与细菌核糖体的30S小亚基结合，干扰氨酰-tRNA与核糖体的结合，阻碍细菌蛋白合成进程，从而达到抑制细菌繁殖的效果。由于土霉素毒副作用小，生产率高，因此在医疗，尤其是在畜牧业的医疗中广泛应用[1-3]。

要提高土霉素产量，除了要求生产菌株具备优良的生产性能外[4]，还必须要有合适的培养基。不同的菌株对培养基组分要求不同，同为龟裂链霉菌属的不同菌株对培养基有着不同的需求。因此，筛选出土霉素高产菌株后还需对培养基进行优化，提高发酵产量，达到最高生产效率，同时尽量降低生产成本。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种

菌种是实验室保存的土霉素产生菌(土壤来源)。

1.1.2试剂

土霉素标准品(HPLC≥95%)，北京索莱宝科技有限公司销售；葡萄糖、草酸、硫酸铵、碳酸钙、硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸铁、氯化钠、琼脂粉、氢氧化钠、氯化钴、硫酸锌、盐酸、氯化铁等均国产分析纯；可溶性淀粉、麸皮、黄豆饼粉、玉米浆、小米、蛋白胨、玉米淀粉、3，5-二硝基水杨酸(DNS)试剂等均为本地试剂公司销售的实验用品。

1.1.3仪器

TU-1901紫外分光光度计，北京谱析通用仪器公司；MULTIPLEX1R32R大型离心机，赛默飞世尔科技公司；霉菌培养箱MJ-16085-III，上海新苗医疗器械制造有限公司；ZHWY2102C立式双层恒温摇床，上海智城分析仪器制造有限公司。

1.1.4培养基

1.1.4.1土霉素生产菌种活化培养基

(1) 菌种活化培养基1号(g/L)：可溶性淀粉25、酵母粉2、蛋白胨1、氯化钠2.5、硫酸镁2.5、磷酸二氢钾0.5、磷酸氢二钾0.5、琼脂粉18、去离子水，调pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，条件下灭菌20 min。

(2) 菌种活化培养基2号(g/L)：麸皮65、琼脂粉20、去离子水，调pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，条件下灭菌20 min。

1.1.4.2土霉素生产菌种种子培养基[5,6]

(1) 菌种种子培养基1号(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨3、氯化钠2.5、碳酸钙0.2、1%小米浸提物、去离子水，调pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，条件下灭菌20 min。

(2) 菌种种子培养基2号(g/L)：玉米淀粉30、黄豆饼粉3、硫酸铵4、碳酸钙5、玉米浆4、氯化钠5、磷酸二氢钾0.1、去离子水，调pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，条件下灭菌20 min。

(3) 菌种种子培养基3号(g/L)：可溶性淀粉30、玉米浆5、氯化钠2、硫酸铵6、碳酸钙3、磷酸二氢钾4、去离子水，调pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，条件下灭菌20 min。

1.1.4.3土霉素生产菌种发酵培养基[6,7]

(1) 发酵培养基1号(g/L)：玉米淀粉150、黄豆饼粉20、碳酸钙12、硫酸铵14、氯化钠4、玉米浆4、磷酸二氢钾0.1、氯化钴0.01、消泡剂0.1、去离子水，调pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，条件下灭菌20 min。

(2) 发酵培养基2号(g/L)：玉米淀粉120、黄豆饼粉20、碳酸钙15、硫酸铵15、氯化钠4、玉米浆10、磷酸二氢钾0.1、氯化钴0.01、消泡剂0.1、淀粉酶0.12、去离子水，调pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，条件下灭菌20 min。

(3) 发酵培养基3号(g/L)：玉米淀粉90、黄豆饼粉30、碳酸钙9、硫酸铵10、氯化钠25、玉米浆10、磷酸二氢钾0.5、硫酸锌0.02、去离子水，调pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，条件下灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1土霉素生产菌的分离、纯化

将实验室保存的土霉素产生菌斜面或茄子瓶孢子刮下加入到装有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，在恒温震荡摇床200 r/min震荡5 min后得分散的孢子液，调整浓度为105CFU/mL；涂布平板后，先在37 ℃条件下培养3 d，然后转到30 ℃，继续培养1 d，得到分散生长的单菌落，观察其形态[4,8-9]。而后将不同的单菌落上的孢子分别制成低浓度的孢子液，涂布平板，得到纯化单菌落菌株[10-12,14]。

1.2.2土霉素生产菌株的抑菌活性检测

在37 ℃平板培养3 d的单菌落，用灭菌的打孔器将单菌落连同琼脂取出后，置于均匀涂布八叠球菌菌悬液的平板上，在30 ℃条件下培养1 d，测量其抑菌圈直径，通过对抑菌圈大小的统计和分析，比较不同菌株的抑菌活性[6,12-13,15-16]。

1.2.3菌株产生土霉素效价的测定

将待测土霉素的发酵液用草酸酸化至pH 1.5～1.7，静置5 min后过滤；取1 mL滤液与9 mL 0.01 mol/L盐酸和10 mL 0.05%氯化铁溶液混合，摇匀，静置20 min后，测定其OD480 nm，经过公式计算得到效价。1 mL滤液与19 mL 0.01 mol/L盐酸混合，摇匀，静置20 min，作为对照组[17,18]。

土霉素标准曲线的制备是以土霉素标准品为标准物，盐酸和氯化铁配制的溶液为显色剂，得到的回归方程式为y=8 763.9x+149.32，R2=0.993 2。

效价计算公式：

土霉素总效价=土霉素效价×稀释倍数

1.2.4土霉素生产菌株的菌种活化

将在活化培养基2号中保存的菌株B用无菌水配置成一定浓度的孢子液，在菌种活化培养基1号上均匀涂布，在37 ℃条件下培养3 d后转到30 ℃条件，继续培养1 d，获得活化的土霉素生产菌株B。

1.2.5土霉素生产菌最适种子培养基

将一定浓度菌株B的孢子液取出3份2 mL，分别转接到装有35 mL种子培养基1号、2号和3号的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min条件下摇瓶培养1 d。各取出2 mL，分别转接到装有35 mL发酵培养基1号的三个250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min培养。在培养期间每2 d测一次发酵液中的土霉素效价，观察种子培养基种类对土霉素产量的影响[3,9]。

1.2.6土霉素生产菌最适发酵培养基

(1) 最适发酵培养基的选择

从土霉素生产菌株B孢子液中吸取2 mL转接到装有35 mL种子培养基2号的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min条件下培养1 d后，分别取2 mL种子液转接到装有35 mL发酵培养基1号、2号和3号的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min条件下摇瓶培养。在培养过程中每2d测一次发酵液中的土霉素效价，观察发酵培养基种类对土霉素产量的影响。

(2) 淀粉酶预处理发酵培养基对土霉素发酵的影响

淀粉酶(3 700 U/g)与天然成分(玉米淀粉、黄豆饼粉、玉米浆)按1∶1 250的比例混合，加入适量去离子水，调节pH 6.5，在45 ℃，160 r/min条件下，摇瓶反应3 h后，再添加其它发酵培养基成分和去离子水，高温高压灭菌，使预处理所添加的淀粉酶失活。

将菌株B孢子液吸取2 mL，加入到装有35 mL种子培养基2号的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min条件下，摇瓶培养1 d。从中吸取2份2 mL，分别转接到装有35 mL经过淀粉酶预处理的发酵培养基2号的250 mL三角瓶和装有35 mL未经淀粉酶处理的发酵培养基2号的250 mL三角瓶中对照，均在30 ℃，220 r/min条件下，摇瓶培养。在培养过程中每2 d测一次发酵液中的土霉素效价，观察淀粉酶预处理的发酵培养基对土霉素产量的影响。

1.2.7发酵过程中的淀粉酶活力与菌株产生土霉素的关系

将2 mL的三种不同种子液分别转接到装有35 mL发酵培养基2号的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min条件下摇瓶培养。测定不同时期发酵液中的淀粉酶活力和土霉素效价，观察淀粉酶活力与土霉素产量的关系。

淀粉酶活测定采用DNS法[19,20]，以无水葡萄糖为标准物，DNS试剂为显色剂，在540 nm处测定其吸光值，得到的回归方程式为y=7.816 7x+0.018 4，R2=0.998 1。

取10 g可溶性淀粉，加入到100 mL容量瓶定容，配成100 mg/mL的淀粉溶液，将待测土霉素的发酵液倒入离心管中，6 000 r/min条件下离心10 min。取1.5 mL淀粉溶液加入到试管中,再取1 mL上清液加入到试管中，30 ℃水浴加热10 min后，取0.5 mL水解液加入到25 mL试管中，再向试管中加入1.5 mL DNS试剂和1.5 mL去离子水，沸水浴 5 min，冷却后定容至25 mL，测OD540nm，经过公式计算得到淀粉酶活力。取0.5 mL淀粉溶液、1.5 mL DNS试剂和1.5 mL去离子水，沸水浴 5 min，冷却后定容至25 mL，作为对照组。

淀粉酶活力定义为，在30 ℃、pH 6.0的条件下，每分钟水解淀粉生成1 mg还原糖所需的酶量为一个活性单位(U)。

10——发酵液与底物反应时间/min

0.5——水解液体积/mL

1——发酵液体积/mL

2 结果与讨论

2.1 土霉素生产菌的分离、纯化与抑菌活性

2.1.1土霉素生产菌株的形态特征

将斜面保存的菌株孢子用无菌水制备均匀孢子液，进行稀释后，涂布平板分离，并观察其产生菌落的形态特征，结果如图1。

在分离平板上出现了三种不同特征的菌落，菌落A、菌落B、菌落C。对三种菌落的孢子再次进行稀释、涂布后得到单一菌落，结果如图2。

菌落A密实洁白，质地硬，表面为车轮状，孢子丰满；菌落B密实，棕褐色，质地硬，表面为车轮状，孢子量不丰满；菌落C密实，深褐色，质地硬，表面为车轮状，孢子较少。

2.1.2土霉素生产菌株的抑菌活性

从供试混合菌中分离得到的三种菌落(A,B,C)中的菌株在涂布八叠球菌培养基上，能够形成明显的抑菌圈，结果如图3和表1。

通过测量产生抑菌圈大小，统计和分析后发现，菌株B产生的抑菌圈平均直径最大为27.25 mm，且效果最稳定，抑菌圈边缘清晰，对八叠球菌抑菌活性最明显；菌株C虽抑菌圈边缘清晰，有明显抑菌活性，但抑菌效果不稳定；菌株A抑菌圈边缘模糊，抑菌圈平均直径较小，且抑菌效果不稳定。因此将菌株B作为后续试验的出发菌株。

Ⅰ 分离平板

Ⅱ 三种不同菌落的形态(A,B,C)

菌落 A

菌落 B

菌落 C图2 菌株菌落特征

菌落 A

菌落 B

菌落 C图3 土霉素生产菌株产生的抑菌圈

表1 菌株(A,B,C)的抑菌圈直径

2.2 土霉素生产菌(菌株B)在未经优化生产条件下的最适发酵时间

将菌株B用种子培养基2号制成种子液，转接到发酵培养基2号中，在一定条件下摇瓶培养，每2 d测定其土霉素效价，结果如图4。

图4 培养时间对菌株产生土霉素的影响

由种子培养基1号制成的菌株B种子液，在发酵培养基2号上进行培养时，培养前4 d土霉素累积量最快，第4 d后进入缓慢增长期，在第8 d时达到最高8 943 U/mL。因此菌株B在发酵培养基2号上产生土霉素的最适培养时间确定为8 d。

2.3 土霉素生产菌(菌株B)的最适种子培养基

将菌株B分别用种子培养基1号、2号和3号制成3种种子液，再分别转接到发酵培养基1号中，在一定条件下摇瓶培养8 d，发酵过程中土霉素产量与时间的关系如图5所示。

图5 不同种子培养基对发酵产生土霉素的影响

由图5可见，通过对土霉素效价变化比较发现，三种种子培养基培养的菌株B在发酵培养的前4 d，土霉素均大量累积，而第4 d到第6 d累积速度变慢，但第6 d后土霉素累计速度再次加大，出现峰值。种子培养基1号中含有葡萄糖和小米，葡萄糖较淀粉更易利用，因此，转接时种子培养基1号中的菌株发育程度更高，转接到发酵培养基进行发酵培养时可以更短时间进入次级代谢，积累土霉素。小米中含有大量天然淀粉，刺激菌株产生淀粉酶，提高菌株产淀粉酶活力，后续发酵过程提高菌株利用淀粉能力。

种子培养基1号培养的菌株B发酵积累土霉素量均比其它两种种子培养基培养的菌株B高，效价为9 533 U/mL，提高了6.59%。因此将种子培养基1号为菌株B发酵生产土霉素的最适种子培养基。

2.4 土霉素生产菌(菌株B)的最适发酵培养基

将菌株B用种子培养基1号制成种子液，取三份2 mL，分别转接到发酵培养基1号、2号和3号中，在同一条件下摇瓶培养，每2 d测定其土霉素效价，结果如图6所示。

图6 不同发酵培养基对菌株产生土霉素的影响

如图6所示，由种子培养基1号制成的菌株B种子液，在发酵培养基1号、2号和3号中培养时，土霉素效价均随发酵时间延长而增加。其中菌株在发酵培养基2号中培养的前2 d，土霉素累积速度较慢，但从第2 d开始土霉素累积量增加，速度加快，且趋势稳定；而发酵培养基1号和3号的土霉素积累量随培养时间增加，但均比发酵培养基2号积累的土霉素少，发酵培养基2号中最终效价为10 247 U/mL，又提高了7.49%，因此发酵培养基2号为菌株B的最适发酵培养基。

发酵培养基2号中成分与1号相比，玉米浆浓度更大，玉米淀粉浓度更小；与3 号相比，玉米淀粉浓度更大，黄豆饼粉浓度更小。培养基中碳氮比最高的1号产量最低，碳氮比最低的2号产量最高。从这个角度来看，碳氮比低更适合菌株B发酵生产，但是具体的比例在什么范围内最好，碳源和氮源的浓度在何范围内更适合生产还需要进一步实验。

将菌株B用种子培养基1号制成种子液，取两份2 mL，分别转接到未经淀粉酶预处理的发酵培养基2号和经淀粉酶预处理的发酵培养基2号中，在同一条件下摇瓶培养，每2 d测定其土霉素效价，结果如图7所示。

对发酵培养基2号成分的淀粉酶预处理研究发现(见图7)，经淀粉酶预处理的发酵培养基2号中，菌株B对土霉素累积速度明显比未经淀粉酶处理的快，而且在培养第6 d时效价达到最高11 023 U/mL，又提高了7.57%，并趋于平稳。

目前土霉素生产菌株普遍存在产淀粉酶能力较低，淀粉利用率较弱的现象，发酵培养基经过淀粉酶预处理，其碳源被水解更容易被利用，从而大大提高物料利用率，缩短发酵生产土霉素时间。因此，发酵培养基配制前，对天然成分进行淀粉酶预处理，可增加土霉素产量。但是发酵培养基预处理时的淀粉酶与天然成分的比例和处理时间仍需进一步研究。

但是生产的前6 d产量持续上升，因此峰值在4 d～6 d区间内出现，为得到更加准确地生产时间，下一步应从第4 d开始，每2 h测一次效价，进一步得到最佳发酵时间。

2.5 菌株产淀粉酶能力与其土霉素产量的关系

将菌株B用种子培养基1号制成种子液，转接到发酵培养基1号中，在一定条件下摇瓶培养8 d，每2 d测定其发酵液中的土霉素效价和淀粉酶活力，结果如图8。

图8 菌株土霉素产量与其淀粉酶活力的关系

由图8可见，由种子培养基1号制成的菌株B种子液，在发酵培养基1号上进行培养，通过比较其中土霉素效价和淀粉酶活力的变化趋势发现，从发酵第2 d开始菌株土霉素积累加速，第4 d时进入缓慢期，但从第6 d起又进入土霉素积累快速期。与之相比淀粉酶的酶活从种子液到发酵结束，保持一定水平，没有明显的波动。但是淀粉酶预处理发酵培养基可以明显提高产量，因此需要进一步研究淀粉酶与土霉素生产之间的关系。本实验中只研究了发酵液中淀粉酶活力变化与土霉素产量变化之间的关系，下一步应对种子液中淀粉酶活力与土霉素最终产量之间的关系进行研究。

3 结论

(1) 在最适种子培养基选择实验中发现，以种子培养基1号作为种子培养基时，发酵产生土霉素的产量更高，并且种子培养基1号具有配方简单，易配制等优点，综合分析后，种子培养基1号为最适种子培养基。在最适发酵培养基的选择实验中，发酵培养基2号为最适发酵培养基，效价达到10 247 U/mL。而且发酵培养基2号经淀粉酶预处理可以有效缩短发酵时间至6 d，效价达到11 023 U/mL。因此，综合考虑生产成本、生产效益等因素，菌株B在经过淀粉酶预处理的发酵培养基2号中发酵培养6 d为最佳。

(2) 发酵液中的淀粉酶活力的变化与菌株土霉素产量的变化没有明显关系，土霉素产量增加加快时，淀粉酶活力没有相应增加。

(3) 在未优化的生产条件下发酵培养，原混合菌产量为6 430 U/mL，菌株B产量为8 943 U/mL，高于原混合菌39%。菌株B在经过淀粉酶预处理的发酵培养基2号中发酵培养6 d的产量为11 023 U/mL，较未分离纯化原菌株效价提高了71.43 %。由此可见，通过筛选优良菌株、优化生产条件提高微生物次级代谢产物的方法是经济有效的。