搅拌桨组合对土壤杆菌产可得然胶的影响

万 婕， 王贻峰， 高红亮， 解秀娟， 杨雪霞*

1.东华大学 化学化工与生物工程学院, 上海 201620; 2.华东师范大学 生命科学学院, 上海 200241;3.上海东圣生物科技有限公司, 上海 201609

可得然胶主要是由土壤杆菌属(Agrobacterium)的细菌在氮源不足、碳源过量的条件下产生的一种水不溶性β-D-1,3-葡聚糖。该多糖具有独特的热凝胶性和良好的生物活性，在食品、医药、生物材料等领域受到了广泛的关注[1-3]。为提高可得然胶产量，降低可得然胶生产成本，研究者在可得然胶菌株选育、培养基及培养条件优化等方面做了大量的工作。KIM等通过菌株诱变及培养条件优化，突变菌株的可得然胶产量比出发菌株提高18.8%[4]。LEE等通过优化培养基碳源，可得然胶产量达到60 g/L[5]。ZHENG等通过调整培养基碳氮比及补料发酵工艺优化，可得然胶产量达到67 g/L[6]。

作为水不溶性胞外多糖，合成的可得然胶包裹着细胞，影响氧气从发酵液进入细胞，因此在可得然胶发酵中，随着可得然胶合成量增加，易造成氧传递困难，制约可得然胶产量的进一步提高。通过提高搅拌转速可以促进传质，但该方法不仅增加能耗，而且易引起菌体代谢异常、产品质量下降。搅拌桨是生物反应器的重要组成部分，通过改变反应器的搅拌桨及其组合，可以优化传质，提高发酵效果。LAWFORD等使用轴流式搅拌桨代替径流式搅拌桨提高了可得然胶的质量，进一步结合通入富氧空气提高了可得然胶产量[7,8]。孙京云等探究了在可得然胶连续流加葡萄糖发酵工艺中两种搅拌桨组合(三层桨均为六平叶径流桨3RT和底层桨为六平叶轮径流桨、上层桨为椭圆桨RT+E)对发酵的影响，发现两种搅拌桨引起的溶氧变化不同，3RT组合时溶氧好于RT+E组合，但RT+E组合能更好促进发酵液内部的混合，导致可得然胶产量略有提高[9]。目前关于搅拌桨组合对可得然胶发酵影响的研究较少。另外，作为一种均一葡聚糖，可得然胶分子大小对其特性及应用影响显著，目前研究很少关注搅拌桨组合对发酵产生的可得然胶分子量的影响。

本文以土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)761031-45A为对象，考察了六种搅拌桨组合对可得然胶发酵和分子量的影响，为可得然胶的工业化生产奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

(1) 菌株

土壤杆菌(Agrobacteriumsp.)761031-45A，本实验室保藏。

(2) 培养基

种子培养基(g/L)：蔗糖20.0，KH2PO41.5，(NH4)2HPO45.0，MgSO4·7H2O 1.0，CaCO33.0，调pH至7.0。

发酵培养基(g/L)：蔗糖100.0，KH2PO42.0，(NH4)2HPO43.0，MgSO4·7H2O 1.0，酵母粉4.5，CaCO32.0，消泡剂0.5，调pH至7.0。

上述培养基灭菌方式均为121 ℃，20 min。

(3) 搅拌桨类型及其组合方式

实验选用六直叶圆盘桨(DT)、非对称抛物线圆盘桨(BT-6)、六箭叶圆盘桨(ADT)、六斜叶圆盘桨(PDT)和半圆管圆盘桨(CD)五种搅拌桨的六种组合。六种组合中，下层桨均采用六直叶圆盘桨，上层桨和中层桨组合见图1。搅拌桨组合1#为DT+PDT，搅拌桨组合2#为BT-6+PDT，搅拌桨组合3#为BT-6+BT-6，搅拌桨组合4#为PDT+ADT，搅拌桨组合5#为CD+CD，搅拌桨组合6#为BT-6+ADT。

图1 六种搅拌桨组合的上层桨和中层桨

1.2 实验方法

(1) 培养方法

种子培养：斜面保藏的菌种取2环菌苔于种子培养基(50 mL/250 mL三角瓶)，250 r/min，30 ℃摇床振荡培养14 h。

发酵培养：10 L发酵罐(T&J QType，上海迪必尔生物工程有限公司)装液量6 L，接种量为5%(v/v)，通气量为1 vvm，搅拌转速为500 r/min(0 h～12 h)、700 r/min(12 h～36 h)、800 r/min(36 h～72 h)，30 ℃培养。考虑到取样和水份蒸发，在发酵36 h和48 h时分别补水0.5 L，维持发酵体积。

(2) 可得然胶产量和菌体干重测定

按照KALYANASUNDARAM等的方法进行测定[10]。

(3) 蔗糖含量的测定

3,5-二硝基水杨酸(dinitrosalisylic acid，DNS) 比色法[11]。

(4) 氨态氮含量测定

水杨酸钠-次氯酸钠比色法[12]。

(5) 发酵液粘度测定

取发酵液，选取相应转子，用粘度计NDJ-5S(上海昌吉地质仪器有限公司)进行测量。

(6) 体积溶解氧系数KLa测定

采用亚硫酸盐法测定KLa。在搅拌转速为500 r/min、通气量为1vvm条件下测定不同搅拌桨组合时的KLa[13]。

(7) 可得然胶分子量测定

分子量测定采用凝胶渗透色谱法(GPCmax VE-2001，Malvern，UK)。可得然胶溶解在DMSO中(终浓度为0.3 mg/mL)，并以DMSO为流动相，流速为0.5 mL/min，在配备有I-MBHMW-3078极性有机柱(300 mm×7.8 mm，CLM1013，Malvern)的Viscotek RImax系统上进行测定。

2 结果与讨论

搅拌是影响发酵效果的主要因素之一，不同类型的搅拌桨在发酵罐中产生不同的流体形态、剪切力分布、气含率分布等，进而影响微生物生长及产物合成。组合不同类型搅拌桨，发挥其各自优势，能够提高微生物发酵生产效率。实验选用五种搅拌桨，采用六种组合，考察不同搅拌桨组合对可得然胶发酵的影响。

2.1 搅拌桨组合对体积溶解氧系数的影响

实验测定了不同搅拌桨组合下的KLa，结果见图2。根据KLa值的大小，可以把搅拌桨组合分为3类，一类搅拌桨组合所得体积溶解氧系数低，如搅拌桨组合1#，KLa值为303.6 h-1；一类搅拌桨组合所得体积溶解氧系数中等，如搅拌桨组合4#，KLa值为428.6 h-1；一类搅拌桨组合所得体积溶解氧系数较高，如组合2#、3#、5#和6#，KLa值大于500.0 h-1，其中组合6#的体积溶解氧系数最高，为547.6 h-1。可见搅拌桨组合对发酵罐中氧传递速率影响显著。组合1#和组合2#的区别只在于上层桨不同，组合1#上层桨为DT，组合2#上层桨为 BT-6，组合2#氧传递效果好于组合1#。组合4#和组合6#的区别也只有上层桨不同，组合4#上层桨为PDT，组合6#上层桨为BT-6，组合6#氧传递效果好于组合4#。BT-6 搅拌器的特点是采用了上下不对称的结构设计, 有助于捕获和分散气体，气液传质系数高[14,15]，故上层桨为BT-6的组合2#、组合6#和组合3#发酵体系溶解氧系数高。CD桨与BT-6桨均为弯叶桨，在传质方面有类似之处，故上层桨和下层桨均为CD桨的组合5#发酵体系的溶解氧系数也较好。

图2 不同搅拌桨组合下的体积溶解氧系数

2.2 搅拌桨组合对可得然胶发酵的影响

可得然胶发酵过程中发酵体系溶解氧变化如图3所示，不同搅拌桨组合时发酵体系溶解氧变化规律相似，主要分为四个阶段。在0 h～12 h区间，体系溶解氧迅速降低，这主要归结为接种后，菌体生长迅速，对氧的需求量大。在12 h～18 h区间，溶解氧逐步回升，此时菌体开始进入产胶期，对氧的需求降低。在18 h～54 h区间，溶解氧不断降低，除搅拌桨组合5#，其余组合均出现溶解氧为零，其中36 h和48 h 处的溶解氧稍有回升主要是此时补水导致。54 h之后，发酵体系溶解氧开始回升。从溶解氧水平看，搅拌桨组合为5#时体系的溶解氧水平高于其它搅拌桨组合，在整个发酵过程中溶解氧均在30%以上。搅拌桨组合3#发酵体系中溶氧水平仅次于搅拌桨组合5#。搅拌桨组合为1#时体系的溶解氧水平最低。

图3 搅拌桨组合对可得然胶发酵体系溶解氧的影响

六种搅拌桨组合对可得然胶产量的影响如图4A所示。0 h～12 h为菌体生长阶段，此时无可得然胶产生；12 h后进入可得然胶合成阶段，其中24 h～48 h为可得然胶快速合成期。搅拌桨组合5#所得可得然胶产量最高，其次为组合6#，产量分别达到58.2 g/L和56.7 g/L。组合1#产量最低，为42.9 g/L。

菌体干重变化见图4B。0 h～24 h菌体干重快速增加，产胶期菌体干重稳定，发酵后期菌体干重略有下降，可能是部分菌体衰老裂解。搅拌桨组合5#所得菌体干重最大，其次为组合6#，菌体干重分别为4.2 g/L和3.9 g/L。搅拌桨组合1#所得菌体干重最低，为3.2 g/L。

发酵过程中蔗糖消耗变化如图4C所示，0 h～48 h阶段，蔗糖快速消耗，蔗糖含量从110 g/L左右降为15 g/L左右。72 h时，蔗糖基本利用完。搅拌桨组合1#消耗蔗糖速率最快，但菌体干重和可得然胶产量却较低，说明该搅拌桨组合不适合菌体生长和可得然胶产生。

搅拌桨组合对发酵液pH的影响见图4D。不同搅拌桨组合下发酵体系pH变化趋势比较一致，0 h～12 h 期间pH由7不断下降至pH 5.5左右。在12 h～48 h区间pH稳定在 5.5左右，此pH也是可得然胶合成的最适pH；48 h后pH不断上升至6.0左右，这是可能是由于碳源耗尽，菌体进入衰亡期，细胞裂解物释放导致pH升高。

注：搅拌桨组合1#★；2# □；3# ▲；4# ▽；5# ■；6# ○图4 不同搅拌桨组合时可得然胶合成代谢曲线

不同搅拌桨组合时，可得然胶得率及生产强度见表1。可得然胶的得率和可得然胶的产量有相同的趋势。搅拌桨组合5#和6#获得最大得率和生产强度，得率分别为0.55 g/g蔗糖和0.53 g/g蔗糖，生产强度分别为0.81 g/L/h和0.79 g/L/h。组合1#可得然胶得率和生产强度最低，分别为0.42 g/g蔗糖、0.60 g/L/h。这表明使用搅拌桨组合5#或6#可得然胶发酵效果最好，使用组合1#可得然胶发酵效果较差。

发酵液粘度变化如图5所示，在0 h～24 h间，发酵液粘度变化不大，此阶段主要是菌体生长，合成的可得然胶较少。在24 h～48 h间，发酵液粘度随发酵时间延长快速增加，此阶段为可得然胶快速合成期，可得然胶产量的增加使得发酵体系粘度增加。48 h后，发酵体系粘度增加缓慢。对比六种搅拌桨组合体系的发酵液粘度发现，搅拌桨组合5#所得发酵液粘度最低，48 h时发酵液粘度为1 290 mPa·s；其次是搅拌桨组合6#，48 h时发酵液粘度为2 200 mPa·s；其它搅拌桨组合所得发酵液粘度均较高，在(2 500～3 000) mPa·s之间，相互间差异不显著。有研究表明粘度是影响KLa的最主要因素之一，随着粘度增加KLa迅速减小[9]。可得然胶发酵中，不同搅拌桨组合可能造成微生物代谢差异，导致发酵液粘度不同，影响发酵体系溶解氧水平，最终影响产物合成。

表1 搅拌桨组合对可得然胶得率和生产强度的影响

注：同行小写字母不同表示组间存在显著性差异(P<0.05)

图5 搅拌桨组合对可得然胶发酵体系粘度的影响

综上所述，搅拌桨组合5#的发酵体系溶解氧较好，无论菌体生长期还是产胶期，发酵体系溶解氧均能满足要求，有利于菌体增殖和可得然胶合成，体系粘度较低。5#搅拌桨组合上层和中层均采用半圆管圆盘浆，这种桨型较一般的直叶桨型载气量提高，改善了传质和分散能力，用作气体的分散特别有效，且剪切小，这样既能保证发酵时的溶氧供给，又减少了对菌体的剪切影响[16,17]。搅拌桨组合1#最不适合菌体生长和可得然胶合成，其原因可能是上层直叶桨剪切力过强，对菌体生长及产物合成造成不利的影响。

2.3 搅拌桨组合对可得然胶相对分子量的影响

可得然胶为大分子多糖，其相对分子量在5.3×104～2.0×106之间[18]。SAIT等[19]研究表明，发酵过程中培养基的营养状况、溶解氧等条件都会影响可得然胶的聚合度，从而影响可得然胶的品质。不同搅拌桨组合所得可得然胶的相对分子量如图6所示，菌株761031-45A所产可得然胶相对分子量在1.1×106以上。在不同搅拌桨组合下，在发酵后期(48 h～72 h)，可得然胶相对分子量均随发酵时间延长而降低，这可能是因为发酵后期细胞衰老，发酵体系传质效果降低，部分菌体裂解，释放的酶导致可得然胶分子水解[20]。搅拌桨组合为5#和3#时，相对分子量下降相对缓慢，在72 h时相对分子量分别为1.50×106和1.46×106。相对分子量降低最快的是搅拌桨组合2#，发酵36 h时的相对分子量为1.88×106，72 h时降为1.14×106。

图6 搅拌桨组合对可得然胶分子量的影响

3.4 结论

在6种搅拌桨组合中， 5#搅拌桨组合(半圆管圆盘桨+半圆管圆盘桨+六直叶圆盘桨)更适合可得然胶发酵，所得可得然胶产量、得率及生产强度最高，分别为58.2 g/L、0.55 g/g蔗糖和0.81 g/L/h，其次为6#组合。不同搅拌桨组合对发酵体系pH变化和蔗糖消耗影响一致。使用5#搅拌桨组合时，在整个发酵过程中溶解氧均在30%以上，发酵体系的粘度低于其它搅拌桨组合体系，所得可得然胶分子量相对稳定。通过选择合适的搅拌桨可以提高可得然胶产量和特性。