响应面法优化多层滴丸中长双歧杆菌R175活菌数检测方法

刘 峰， 马 俊

深圳万和制药有限公司，广东 深圳 518107

长双歧杆菌是婴儿、成人、老人肠道菌群中最普遍存在的双歧杆菌[1，2]。尽管肠道菌群的组成可能随着宿主饮食结构的变化发生改变，但一些特定的长双歧杆菌却可以在宿主肠道内持续的存在[3，4]。它具有防治便秘[5]、抑制肠道致病菌[6]、调节肠道菌群、降低胆固醇[7]、促进营养物质的消化吸收[8]、延缓衰老[9]和增强机体免疫活性[10，11]等生理功能。

尽管双歧杆菌不同菌株的耐受性有很大差异，双歧杆菌属对低pH值还是表现出高度的敏感性[12]。MASCO L等[13]指出，长双歧杆菌在pH值为3的条件下处理1 h即开始大量减少； MAINVILLE I等[14]指出，动物双歧杆菌的耐受性要明显优于长双歧杆菌和婴儿双歧杆菌。因此动物双歧杆菌最先在欧洲被用于生产乳制品[13,15]。

双歧杆菌已被广泛应用于食品、医药、饲料等各个领域。然而，长双歧杆菌对生存环境要求苛刻，并且不能耐受人体消化道环境，难以保障足够的活菌数到达人体肠道定植[15]。

滴丸是固体或液体药物与适宜的基质加热融化、乳化或混悬于基质中，再滴入不相混溶、互不作用的冷凝液中，由于表面张力的作用使液滴收缩冷却成小丸状的制剂[16]。多层滴丸是将药物有效成分放在最内层，并包括覆盖最内层的内皮层，以及覆盖该内皮层构成的三层或三层以上的具有一定硬度的无缝胶囊制剂。最内层包含一种油相载体，可以将活菌菌粉均匀分散；内皮层是以固化油为主要成分的内皮膜，可以防止水分进入内层；外层是蛋白质类的外皮膜，具有物理硬度，滴丸不易变形。

在《中国药典》的微生态活菌制品总论中，只有胶囊剂和粉剂的检测方法，尚未列出其它不同制剂形式的微生态活菌制品的活菌数检测方法，更无滴丸这类产品的检测手段。而多层滴丸采用多种不同的材料将长双歧杆菌层层包裹，在进行活菌数检测的时候，使用常规的方法(中国药典法、国标GB4789.35、国际标准ISO29981)都无法将其从复杂的成分中释放出来，也就无法准确检测其活菌数，为此我们开发了一项检测方法来解决这个问题。

1 材料和方法

1.1 材料

多层滴丸(自制)，长双歧杆菌菌粉R175(商业购买)。

1.2 主要仪器和试剂

均质机(IKA T25D S25)， 高压灭菌锅(Yamato SN310C)，天平(Sarorius SQP)，天平(Sarorius MSA 224-CE)，天平(Sarorius BSA224S)，超净工作台(苏静安泰 SW-CJ-1FD)，厌氧工作站(SHELLAB BACTRON EZ-2), TOSP Agar(Merck Millipore 100043), Mitsuoka’s buffer (根据配方自行配制)。

1.3 现有方法对多层滴丸中长双歧杆菌R175活菌数的检验

采用三种常规方法，分别是《中国药典》中的微生态活菌制品活菌数测定法，《食品安全标准》中的GB4789.35以及国际标准化委员会的标准ISO29981。

1.4 多层滴丸样品前处理方法的单因素考察

多层滴丸中长双歧杆菌包裹在最内层，需要前处理使其从滴丸中释放出来。我们对其采用37 ℃水浴后，再恒温均质的处理方式：称取149 mL Mitsuoka’s buffer，水浴使其温度恒定在37 ℃，然后加入1 g多层滴丸样品，继续水浴；水浴后，对含有多层滴丸的Mitsuoka’s buffer进行37 ℃恒温均质处理。前处理共考察三个单因素，分别是水浴时间，均质速度和均质时间。

1.5 梯度稀释、涂布培养和计数

取1 mL前处理后的多层滴丸样品加入9 mL Mitsuoka’s buffer，反复吹打混匀，继续10倍梯度稀释至合适的稀释度，取50 μL涂布在TOSP固体培养基(不含莫匹罗星锂)，每个稀释度3个板，37 ℃，40 h～44 h，厌氧倒置培养。培养结束后，取菌落数在30～300个菌落的平板进行计数，并据稀释度计算出每克样品中含有的活菌数。

1.6 检出率

本方法中检出率是指多层滴丸样品中检测到的长双歧杆菌R175活菌数占加入的长双歧杆菌R175活菌数的百分比。

2 结果

2.1 现有方法对多层滴丸中长双歧杆菌R175活菌数的检验

这三种方法是比较常用的检测双歧杆菌活菌数的方法。GB4789.35是食品中乳酸菌活菌数的检测方法。多层滴丸属于固体样品，GB4789.35中对固体样品的前处理方法为样品10倍稀释后，8 000 r/min～10 000 r/min均质1 min～2 min，或用拍击式均质器拍打1 min～2 min，用上述方法处理后的多层滴丸样品，分散性差并有抱团现象，只有少量双歧杆菌从多层滴丸中释放出来，检测到的活菌数不足添加量的1%。ISO29981是乳品中双歧杆菌活菌数的检测方法，对样品的前处理方法是振荡；中国药典中的微生态制剂只有胶囊剂和颗粒剂两种剂型，前处理方法是对10倍稀释的样品充分摇匀。采用这三种处理方法，很难使双歧杆菌活菌从具有一定硬度和无缝包裹的多层滴丸中释放出来，检出率极低。

表1 现有三种方法对多层滴丸中长双歧杆菌R175活菌数的检验结果

2.2 单因素实验

2.2.1不同水浴时间对检出率的影响

因多层滴丸样品的壁材和温度有关，基于壁材熔点及考虑不影响长双歧杆菌存活的温度条件，本实验对样品处理的水浴温度固定为37 ℃，水浴后再进行均质，考察了不同水浴时间对检出率的影响，实验参数及结果见表2。

表2 不同水浴时间对多层滴丸样品检出率的影响

从表1可以看出，多层滴丸样品采用现有三种前处理方法，双歧杆菌被包裹在多层滴丸中，无法释放，基本检测不到活菌。从表2可以看出，经过水浴和均质，才可能检测到其包裹的活菌。随着水浴时间的增加，检出率提高，当水浴时间为10 min时，检出率最高；当继续增加水浴时间时，检出率无明显变化，因此选定水浴时间10 min作为中间水平。

2.2.2不同均质速度对检出率的影响

水浴时间设定为10 min，均质时间设定为5 min，然后采用4个不同均质速度进行考察，实验参数及结果见表3。

表3 不同均质速度对多层滴丸样品检出率的影响

从表3可以看出，当均质速度为8 000 r/min～14 000 r/min时，随着均质速度的提高，检出率升高。均质速度为12 000 r/min时，检出率最高，因此选定均质速度12 000 r/min作为中间水平。

2.2.3不同均质时间对检出率的影响

水浴时间设定为10 min，均质速度均为12 000 r/min，然后采用4个不同均质时间进行考察，实验参数及结果见表4。

表4 不同均质时间对多层滴丸样品检出率的影响

从表4可以看出,在均质时间1 min～5 min范围内，随着均质时间的增加，检出率升高，继续增加均质时间，检出率没有明显变化，甚至稍有下降，可能由于均质时间过长，温度升高，导致部分活菌死亡。因此选定均质时间5 min作为中间水平。

2.3 基于中心复合设计的响应面法优化前处理参数

2.3.1实验设计

根据前期多层滴丸样品前处理单因素考察结果，我们采用基于中心复合设计的响应面法对前处理参数进行优化。以Box-Behnken为模型，以均质速度(A)，均质时间(B)，水浴时间(C)为考察因素，以检出率作为响应值。实验设计及实验结果见表5和表6。

表5 响应面分析试验因素水平表

表6 响应面分析试验设计与结果

2.3.2实验结果分析

以Box-Behnken为模型设计实验，通过SAS9.2软件采用正交旋转二次回归对数据进行方差分析，建立了二次响应面回归模型，并进而求得了最优响应因子水平。所得的分析结果如表7。

从表5～表7可得出二次回归方程为：

检出率(%)=70.46+0.24A+0.80B+2.81C-1.28AB+1.25AC+0.43BC-1.06A2-2.28B2-4.56C2

对上述方程中A、B、C求偏导，得出如下三个方程：

0.24-1.28B+1.25C-2.12A=0

0.8-1.28A+0.43C-4.56B=0

表7 方差分析

2.81+1.25A+0.43B-9.12C=0

解出即得，A=0.231，B=0.143 3，C=0.346 5。对应的各因素水平为均质速度为12 462 r/min，均质时间为5 min 17 s，水浴时间为11 min 44 s。

根据上述回归方程作出响应面分析图，响应面结果见图1～图3。

图1

2.3.3实验验证

为验证优化模型，根据模型优化的试验条件进行试验，理论检出率为71.03%。为检验响应曲面法所得结果的可靠性，采用上述优化条件对三层滴丸进行了三次实验，实际测得的双歧杆菌检出率分别为71.88%，72.22%，71.12%，平均为71.74%，与理论值接近。因此，基于响应面优化多层滴丸中长双歧杆菌R175活菌数检测方法准确可靠。

3 讨论

3.1 本方法的建立使多层滴丸中双歧杆菌的活菌数得到了有效检测

多层滴丸国内外研究较少，尤其是多层滴丸在益生菌方面的应用，鲜有报导，更没有针对滴丸型活菌产品的检测方法。益生菌多层滴丸需要通过多种不同性质的壁材来满足益生菌活着到达肠道的目的，成分复杂并含有大量固化油成分。同时，其外层为保证丸体的完整性，硬度较大，目前常见的前处理方法如ISO29981的振荡，GB4789.35中的8 000 r/min～10 000 r/min均质1 min～2 min，不足以将外层破碎，使中层和内层从滴丸中分散出来。而且，常见方法中没有对样品进行恒温处理，容易造成多层滴丸样品抱团，使内层活菌仍然被包裹或仅一小部分释放到缓冲液中，检测结果和实际偏差较大。为此，对多层滴丸前处理的方法进行了优化。

图2

图3

从本实验结果来看，基于中心复合设计的响应面分析方法对于多层滴丸中长双歧杆菌R175活菌数检测方法的优化，是一个合适的优化工具。影响多层滴丸样品前处理结果的因素包括均质速度，均质时间和水溶时间。响应面分析法从这些因素中找到了最优的样品前处理参数。通过本次研究，我们发现，对多层滴丸使用Mitsuoka’s buffer缓冲液，37 ℃水浴11 min 44 s，12 462 r/min均质5 min 17 s，并采用TOSP培养基，可获得较好的活菌数检测结果。我们优化后活菌数检出率和优化前相比较，比原来GB4789.35的方法提高2个数量级，比ISO29981的方法提高6个数量级。综上，利用响应面法成功地优化了多层滴丸中长双歧杆菌R175活菌数检测方法，可以用于多层滴丸中长双歧杆菌R175的活菌检测。

3.2 显著性分析

由表7可知，回归系数为0.971 9，大于0.9，表明该模型相关性好。P值为0.000 1，说明该模型达到极显著水平(P<0.01)，该实验方法可靠。方程失拟项为0.706 9，大于0.05，所以不显著，说明该回归模型拟合度较好。其中，均质时间(B)的一次项，均质速度(A)和均质时间(B)的交互项，均质速度(A)和水浴时间(C)的交互项，均质时间(B)的二次项均达到显著水平(P<0.05)； 水浴时间(C)一次项和水浴时间(C)二次项均达到极显著水平(P<0.01)。选取的因素对检出率的影响大小依次为：水浴时间(C)>均质时间(B)>均质速度(A)。

通过表6看出，三个因素0水平(37 ℃水浴10 min，12 000 r/min均质5 min)检出率平均值为70.46%，而最优条件(37 ℃水浴11 min 44 s，12 462 r/min均质5 min 17 s)检出率平均值为71.74%，两者检出率差异为1.44%。在统计分析上，两者没有显著性差异，这可能和这个产品的特性有关。在这些因素水平下，检出率可能已经接近极限。通过响应面分析方法，我们发现，和其他水平相比，0水平是较优的条件，同时最优条件的检出率平均值要好于0水平的检出率平均值。因此，我们的实验设计和考察结果具有实用价值。

在实际操作中，样品前处理参数中的转速12 462 r/min较难控制。为了方便操作，在后续的实验中采用可控制的前处理参数：37 ℃水浴11 min 44 s，12 400 r/min均质5 min 17 s。

3.3 建立本检测方法，可以指导益生菌多层滴丸的研发和质量标准的建立

研究表明，益生菌在产品制剂中的活菌数至少要达到107CFU·mL-1或g-1才能对宿主发生益生功能[12]。所以活菌数是评价微生态制剂益生功效的核心指标。

双歧杆菌是应用较多的一类益生菌，双歧杆菌专性厌氧，对氧气、pH、温度、湿度等外界不良环境因素极为敏感[17]，长双歧杆菌作为双歧杆菌属的一个种，对环境也极为敏感，在生产、贮藏和运输的过程中活菌数下降迅速[15]。同时双歧杆菌多不能抵抗动物消化道的胃酸、胆盐及多种消化酶的作用，我们使用多层滴丸的制剂技术帮助双歧杆菌抵抗胃肠道的苛刻环境，来增强其对消化系统的耐受性。

但目前，多层滴丸在益生菌方面的研究较少，针对多层滴丸中的双歧杆菌活菌数的评价，没有合适的方法，得不到有效的数据。为此，需要建立一个针对性的方法，用以评价多层滴丸的核心质量指标即双歧杆菌的活菌数。有了这种检测方法，对益生菌多层滴丸的产品开发具有指导意义，可以通过对活菌数的变化情况来评估工艺的可行性，设定合理的参数；通过长期稳定性研究过程中活菌数的变化规律，制定产品的贮藏条件和具体的保质期。同时也为多层滴丸的质量标准的建立奠定基础。