电导率法筛选镉离子印迹聚合物功能单体

于劲松， 徐 斐， 曹 慧， 袁 敏， 叶 泰， 塔玛夏·提乐努尔，杨 晔， 杨洪志， 王首丰， 张港嘉

上海理工大学医疗器械与食品学院， 上海 200093

近年来，随着环境污染的恶化，重金属镉在食品中污染问题越来越严重[1-3]。目前食品中镉污染严重主要是由于用含镉污水灌溉农田，间接地危及了水生生物与人类安全。镉在人体内主要积聚在肝、肾和内分泌腺中，代谢和被清除的速度缓慢。我国国家标准GB 2762——2005《食品中污染物限量》规定了大米、大豆中镉的限量≤0.2 mg/kg，花生≤0.5 mg/kg，面粉、杂粮等≤0.1 mg/kg；畜禽肉类≤0.1 mg/kg，肝脏≤0.5 mg/kg，而肾脏≤1.0 mg/kg[4]。

以分子印迹技术为基础发展起来的离子印迹聚合技术，为当前重金属特异性结合材料的探索带来了新思路，通过该技术可以制备一种空间结构和结合位点与特定目标离子互补并匹配的聚合物[5-12]。分子印迹技术中，功能单体的选择是很重要的一个步骤，选择的功能单体需要与模板分子结合形成稳定的复合物，这样制备出来的印迹聚合物(MIP)上可以形成功能单体与模板分子相匹配的印迹空穴，因此在制备Cd(II)离子印迹聚合物的过程中，需要筛选出与Cd(II)结合效果最好的功能单体[13-24]。针对筛选对象，提出采用电导法用于离子印迹聚合物功能单体筛选。电导法就是依靠物质电导率这一特性用来筛选分子印迹聚合物功能单体的方法，电导率是溶质溶解在某一溶剂里的导电性能，电导率越大，导电性能越良好，对于电导率而言，影响其大小的因素主要是温度，溶液中溶质种类。浓度相同的不同物质在相同温度下，其电导率是不同的。试验中，我们假设筛选的配体在溶液中与镉发生结合，生成的物质的导电性与配体和镉都会有所差别，因此可以通过反应前后电导率的变化情况去判断配体是否与镉发生反应，以及不同配体与镉反应的强弱。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

(1) 氨基酸类：包括半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、甘氨酸(Gly)等在内的具有水溶性的17种氨基酸、谷胱甘肽(GSH)(优级纯)。

(2) 核苷酸：8种核苷酸：腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP)，鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP)，胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP)，胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP)，腺嘌呤核糖核苷酸(AMP)，胞嘧啶核糖核苷酸(CMP)，鸟嘌呤核糖核苷酸(GMP)，尿嘧啶核糖核苷酸(UMP)，核苷：胞苷、尿苷、腺苷、d胸苷等。

(3)二硫苏糖醇(DTT)、磷酸盐：焦磷酸钠、十二水磷酸氢二钠、葡萄糖-6-磷酸钠、无水磷酸钠；HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)缓冲液，氢氧化钠，盐酸等。

1.2 仪器与设备

低温恒温循环器、恒温震荡仪、磁力搅拌器、LXJ-IIB离心机、电导率仪、pH计。

1.3 实验方法

1.3.1缓冲液、单体、模板溶液的配置

本研究选用的缓冲液是非离子缓冲液HEPES，选用非离子型缓冲液可以减少实验过程中缓冲背景对电导率测试的干扰；配置了不同pH的HEPES的缓冲液：6.8、7.15、7.5、7.85、8.2。单体母液的配置浓度为10 mmol/L(HEPES配置)；模板选用的是氯化镉，模板的母液浓度为0.1 mol/L。

为了测量功能单体和隔离子结合的电导率变化，需要比较不同浓度下，结合后的功能单体和镉离子的缓冲液体系与未结合的功能单体和镉离子的缓冲液体系的电导率的差值。这里定义并配制了A、B、C、D四种溶液，A是仅含有镉离子的缓冲液；B是仅含有功能单体的缓冲液，C是含有功能单体和镉离子的缓冲液体系，D是HEPES缓冲液。其中B和C两种溶液，B1～B4中单体的浓度为1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L，C1～C4中镉离子的浓度为1 mmol/L，功能单体的浓度为1 mmol/L、2 mmol/L、3 mmol/L、4 mmol/L。

1.3.2电导率差值的定义

为了更好地处理实验数据与分析结果，研究中定义了一个电导率差值的物理量。假设筛选的单体在溶液中与镉发生结合，生成的物质的电导率与单体以及镉溶液的电导率之和会有所差别。

电导率差值：Δσ=A-D+(B-D)-(C-D)=A+B-C-D。

公式中，A值代表氯化镉缓冲液的电导率，B值单体缓冲液的电导率，C值单体和氯化镉经一定比例混合后的电导率，D值是缓冲液的电导率。A～D：氯化镉加入到缓冲液后体系电导率变化量，B～D：单体加入到缓冲液后体系电导率变化量，C～D：氯化镉和单体同时加入到缓冲液后体系电导率变化量。电导率差值(Δσ)反映的是功能单体与镉结合强弱，Δσ越大表明该功能单体与重金属镉离子的结合能力越强。

2 结果与讨论

2.1 氨基酸作为功能单体与镉结合前后的电导率测试研究

研究中，共考察了17种氨基酸作为功能单体时，与镉结合前后的电导率变化，试验结果如下图所示：

图1 氨基酸与镉的结合筛选结果

由图1可见，17中氨基酸中半胱氨酸的Δσ最高，在100到110之间；天冬氨酸、天冬酰胺以及谷氨酸的电导率差值位于第二梯队，大约在15到30之间；其它氨基酸的电导率差值都在15以下，说明它们与镉的结合能力较弱。除了半胱氨酸以外，其他氨基酸的电导率差值都随单体浓度增高而升高。从结构上看，这17种氨基酸可以分为两类：含巯基和不含巯基，其中含有巯基的只有半胱氨酸一种，而它的Δσ也远远高于其他的16种氨基酸。在Dokmanic等人的研究中也发现了类似的现象，他们从PDB数据库里选了大约10 000种蛋白质与金属离子结合，结果发现 Cd 与氨基酸形成的结合物 35%以上的配位数(CN，coordination number)为 4，而当配位数为4时，镉离子倾向于和巯基中的硫结合。说明巯基可能在镉离子和氨基酸结合的过程中起到很重要的作用。为了验证这个观点我们又设计另一组试验来研究影响半胱氨酸与镉离子结合性能的主要基团。

不含巯基的氨基酸中，天冬氨酸结构中相比较其它的氨基酸，多了一个羧基-COOH，天冬氨酸σ值高于其它氨基酸，推测-COOH对试验的影响比较大。

2.2 影响半胱氨酸与镉离子结合性能的主要基团

在上组试验中我们发现了半胱氨酸与镉离子有较好的结合性，我们推测可能是巯基在半胱氨酸与镉离子结合过程中起到了主要作用。为了验证这个观点，我们分别选用了二硫苏糖醇(DTT),半胱氨酸(Cys)和谷胱甘肽(GSH)三种含巯基的单体。按照之前的试验步骤，分别研究这三种单体与1 mmol/L ～4 mmol/L这四种浓度的镉离子单体结合后的电导率变化。其结果如图2所示。

图2 三种含巯基单体与镉的结合特性

图中的三条曲线分别是二硫苏糖醇，半胱氨酸和和谷胱甘肽与镉离子结合的电导率变化趋势。它们的电导率差值都很大，在95～110之间，这充分说明了含巯基的单体与镉离子有较好的结合率。其中谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成的三肽，它和镉离子结合后的电导率差值很高，而谷氨酸，甘氨酸与镉离子结合的电导率差值都很低，这反应了与镉离子有良好结合性能的应该是半胱氨酸含有的基团。二硫苏糖醇含有两个巯基，其电导率的差值也比半胱氨酸和和谷胱甘肽要高(高了大约5左右)，这也说明巯基确实有较好的与镉离子结合的能力。以上的试验结果符合经典的软硬酸碱理论：按照该理论对物质进行的划分，镉离子属于软酸，含巯基物质属于软碱，软酸倾向于和软碱结合。因此，含巯基的半胱氨酸、谷胱甘肽和二硫苏糖醇等具有较强的与镉离子结合的能力。

综上，氨基酸的筛选试验结果表明，-SH使得氨基酸与Cd(II)的结合能力更强，所以半胱氨酸的试验效果最好，因此在氨基酸筛选试验中，我们选择半胱氨酸作为后面的待筛功能单体。

2.3 核苷酸作为功能单体与镉结合前后的电导率测试研究

在筛选核苷酸与镉结合能力的实验中，我们选取了8种核苷酸作为我们的实验单体。试验结果如图3所示：

图3 核苷酸与镉结合前后的电导率差值

从图中可以看出dGMP和GMP与镉离子结合的产生的电导率差值最高，数值在60到105之间，其次是腺苷酸和尿苷酸，数值在60到90之间，剩余的四种核苷酸电导率的差值基本相近在20到60之间。与17种氨基酸比较，核苷酸的电导率差值普遍较高，可见核苷酸是一种优异的金属离子配体，有很好的配位性能。与氨基酸不同的是，核苷酸的结合能力差距并没有这么明显。

2.4 影响核苷酸与镉离子结合性能的主要基团

为了进一步研究核苷酸与镉离子的结合性能，我们选择从核苷酸的组成入手分析。核苷酸的结构包含了磷酸，戊糖和碱基三个部分，通过将磷酸盐附在核苷的糖环5，上，就会形成核苷酸。而这些磷酸盐数量从一个到三个不等，本试验选取的都是含有一个磷酸的核苷酸。

研究过程中共选择了四种磷酸盐：焦磷酸钠、无水磷酸三钠、磷酸氢二钠(12水)、葡萄糖-6-磷酸钠，考察它们与镉离子的结合情况，其结果如图3所示。

图4 磷酸盐与镉结合电导率差值变化

从图中可以看出，含有两个磷酸基团的焦磷酸钠电导率差值最大，在150到170之间，其次的是无水磷酸三钠和十二水磷酸氢二钠，电导率差值在60到120之间，最低的是葡萄糖-6-磷酸钠，电导率差值在20到60之间。总体上，含磷酸物质与镉离子的结合能力都很好，且含有的磷酸基团越多，与镉离子结合性能越好。而R基的不同，也会影响与镉离子的结合性能。这个试验也可以证明磷酸基团确实与镉离子有很好的结合能力。

核苷酸的结构中还有核苷，在筛选核苷与镉结合能力的实验中，我们选取了4种核苷作为我们的实验单体，依次为胞苷、尿苷、腺苷与脱氧胸苷，其他几种核苷难溶于水，因此暂且考察了4种核苷。试验结果如图5所示，结果显示：四种核苷的电导率差值都很低，可见它们与镉的结合能力都非常弱，几乎可以忽略不计。

图5 四种核苷与镉结合前后的电导率差值

综合图3，图4和图5的试验结果进行分析，可以确定的是：八种核苷单磷酸结构中的磷酸基团是可以与镉发生较强亲和的部位(图4)；但核苷酸与金属离子镉的结合能力又是有大有小的(图3)，可见磷酸并不是唯一的亲合部位。可以推测，核苷酸中的碱基部分理应与镉离子有亲和作用。但图5的实验结果又是与推测矛盾的。可以给一个这样的解释：单独的碱基与镉离子不能发生亲合，它与镉离子产生亲合是需要条件的，需借助磷酸基团的存在时才可体现出来。磷酸基团起的作用像是打开碱基与镉亲和力的开关，或者类似一个“催化剂”的作用一样。

2.5 功能单体与镉离子结合所需pH的优化分析

研究中考察了本实验中缓冲液的最适pH, HEPES缓冲液的缓冲范围是6.8～8.2，我们在这个范围中进行了多次实验，并用了之前实验的大部分单体来进行实验，以找到最适用于试验的pH。从实验结果中我们可以发现，所有单体在pH 6.8到8.2的范围内的电导率差值都是先上升再下降，在缓冲液pH 7.5时，单体的电导率差值最高，并且几乎所有单体都呈现此种趋势，因此可选择7.5作为最优的单体与镉结合的pH条件。

图6 单体与镉结合后电导率差值与pH的关系

3 结论

离子印迹技术作为新兴的特异性检测和去除重金属离子的技术，目前面临的主要难点在于功能单体的选择，常用的几种分子印迹聚合物都无法很好与重金属离子特异性的结合，而国内外关于相关功能单体的研究还比较少。本文通过研究镉离子与功能单体的结合，希望给之后的功能单体选择研究提供一些帮助。通过实验得到的主要结论是：(1) 镉离子是一种软酸，巯基是一种弱碱，根据软硬酸碱理论，软酸易于软碱发生反应。所以镉离子与巯基有很好的结合性能；(2) 磷酸根带有很多的负电荷，易于含有正电荷的镉离子通过静电作用结合；(3) 在此过程中还优化了缓冲液的pH，通过实验发现缓冲液在 pH为7.5时为最优。

虽然通过电导率法筛选与镉结合的功能单体简单又方便，但是这种方法依然存在着很多不可忽视的问题：(1) 在实验中测出某些单体电导率差值为负数，还未能找出合理的原因来解释此种问题；(2) 由于时间有限，现在筛选的功能单体较少，可能存在其他与镉有更好结合能力的功能单体。