链球菌非编码小RNA研究进展

吕泽轩， 宋 馨， 刘欣欣， 夏永军， 艾连中， 熊智强

上海理工大学医疗器械与食品学院，上海食品微生物工程技术研究中心，上海 200093

链球菌属是一类常见低GC含量的革兰氏阳性细菌，通常是球形或卵形细胞，具有发酵、无氧/厌氧、不运动、过氧化氢酶阴性和无孢子形成等特征，大部分菌株具有低致病性。目前从动物和人类的口腔、呼吸道、皮肤和皮肤表面以及土壤和植物等各种环境中至少发现55种链球菌[1]。根据其溶血特性，链球菌被分为三类：(I)α-溶血型链球菌[2]，如变形链球菌; (II)β-溶血型链球菌[3]，主要包括无乳链球菌和化脓性链球菌; (III)γ-溶血型链球菌，也称为非溶血性链球菌，通常没有致病性[4]。部分链球菌可同时感染人类和动物，如肺炎链球菌、化脓性链球菌和无乳链球菌是可导致急性感染的人类病原体。目前大量的非编码小RNA(Small non-coding RNA, sRNA)在革兰氏阳性细菌中被预测并验证，但对链球菌sRNA的研究主要集中在毒力调节相关，对其他代谢途径和生理功能的调控研究报道较少。

1 细菌sRNA

作为一类重要的转录后调控因子，细菌中存在的sRNA长度为40-500个核苷酸(nt)，通常不会翻译成蛋白质[5]。sRNA从位于开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)之间的基因间区(Intergenic Region，IGR)或5′和3′端非翻译区(untranslated region，UTR)修饰中开始转录[6]。在转录后水平sRNA与mRNA分子互补配对或与相应蛋白质分子相互作用，从而使细菌对环境胁迫的响应发挥调节作用[7, 8]。当外部环境变化时，虽然某些基因的转录可能会停止，但sRNA可以通过快速调节已经转录到细胞中的转录本进行翻译来响应[9, 10]。大多数功能性sRNA通过反义RNA形式与靶向mRNA特异性结合来调控靶基因的表达。目前已发现的细菌sRNA常被作为响应外界环境压力的调节元件，在细胞内的生理过程中发挥关键作用[11]。

因sRNA自身特性，很难通过实验将其识别。首先，sRNA长度小且自身无法编码蛋白质，因此通过单核苷酸突变难以抑制它。其次，sRNA无法翻译成蛋白质，仅通过识别ORF则无法获得其序列。因此，通常选用生物信息学预测与实验验证相结合的方法来预测并鉴定细菌sRNA及其靶基因。生物信息学方法主要是根据序列长度、碱基匹配、RNA二级结构和序列保守性及其位置来预测细菌sRNA的靶标。当前用于预测sRNA靶基因的软件有CopraRNA[12, 13]、sRNATarBase[14]、IntaRNA[15]、RNAPredator[16]、RNAhybrid[17]、sTarPicker[18]、RNAup[19]和TargetRNA2[20]。sRNA靶基因验证已有多种实验方法，目前遗传方法、亲和力技术、免疫共沉淀法和微阵列技术被广泛应用。此外，ribosome profiling(Ribo-seq)是最近开发可同时确定体内转录和翻译水平的一种方法。Wang等[21]通过Ribo-seq验证了RyhB(来自大肠杆菌的一种调节铁利用的sRNA)的已知靶基因，还发现了许多RyhB新的靶标。

随着细菌中越来越多的sRNA被鉴定，反式和顺式sRNA的调控机制逐渐被阐明。反式sRNA在Hfq蛋白(RNA伴侣蛋白)的帮助下，与正在翻译的mRNA的核糖体结合位点(ribosome binding site，RBS)区域碱基互补，形成二级结构，阻止了核糖体的结合，导致蛋白质翻译抑制(图1-A-a)。反式sRNA与靶mRNA碱基互补后，涉及靶mRNA降解的RNaseE可以特异性地作用于富含AU的单链RNA上，同时降解靶mRNA和sRNA(图1-A-b)。顺式编码sRNA可以在Hfq的帮助下直接与目标mRNA进行严格的碱基配对形成双链结构，从而增加mRNA的稳定性，保护mRNA不受RNase E的降解(图1-B)。细菌sRNA可以通过调节细菌的毒力来响应生长条件的变化，使细菌适应生存环境变化[22]，还可以通过调节群体感应系统介导的蛋白质表达来控制细菌密度[23]。在生长环境缺乏营养的情况下，细菌sRNA(如CsrB和CsrC)可以在抗营养胁迫中发挥重要的调控作用[24, 25]。sRNA在细胞代谢中微量元素也不可或缺，可以调控细菌中微量元素的相对平衡。例如sRNA RyhB调节大肠杆菌中Fur(铁吸收调节因子)和福氏志贺菌中的YdeP(负责酸度的调节)[26]的基因表达。除调节耐酸性外，sRNA也可以调节温度[27]和氧气压力[28, 29]等其他环境压力。相同sRNA在不同细菌中可能具有不同的调控机制，导致其多种功能。

图1 反式和顺式sRNA调控机制

2 sRNA在链球菌中的生物学功能

2.1 化脓性链球菌(S. pyogenes)

化脓性链球菌是一种可以引起表面感染(脓疱疮和咽炎)或全身性疾病(坏死性筋膜炎和中毒性休克)的细菌病原体。化脓性链球菌中已鉴定出sRNA，大多数都与毒力调节有关(表1和表2)。

2.1.1sRNA FasX

FasX是一种可影响蛋白质(例如链激酶)的表达并将纤溶酶原转化为纤溶酶的sRNA(～200 nt)[48]。FasX属于fasBCAX操纵子 (fibronectin/fi-brinogen binding/haemolytic activity/streptokinase reg-ulator)，它包括编码两个组氨酸激酶(FasBC)和一个反应调节子(FasA)的基因。FasX通过(I)稳定skamRNA(编码链激酶，毒力因子)来增强链激酶的表达、(II)与控制菌毛生物合成的mRNA碱基配对，使mRNA不稳定来调节菌毛的生物合成和粘附和(III)抑制cpamRNA(编码pilin蛋白)的翻译[49-52]这三个步骤影响毒力因子的表达。

表1 链球菌中的sRNA概览

*NB, northern blots; qRT-PCR, quantitative reverse transcription PCR

表2 链球菌中已研究的sRNA及靶基因功能概览

2.1.2sRNA Pel/sagA和RivX

Pel/sagA(pleiotropic effect locus/streptolysin-associated gene A，～450nt)调节化脓性链球菌中的M及其相关蛋白并编码streptolysin S(毒力因子，SLS)。CcpA(catabolite control protein A)、CovRS/CsRS(two-component regulatory systems，TCS)、LuxS(毒力因子)、Mga(multiple gene activator)、Nra(regulate pilus gene transcription)和RopB/Rgg(Rgg-like transcriptional regulator)多种转录因子均可抑制Pel的表达。此外，Pel的表达还受FasX抑制，在氨基酸缺乏时还可被CodY(pleiotropic repressor)、Irr(编码双组分系统Ihk-Irr)和SLS激活[30]。RivX衍生自转录调节因子RivR的mRNA，有三个5′端可供选择，可形成189、237和289 nt长的sRNA。Mga控制emm(编码M蛋白)，C5a肽酶(C5a peptidase)和speB(编码半胱氨酸蛋白酶)的表达，RivR和RivX均能正向调节Mga，因此可以激活毒力相关调控因子的表达[30]。

2.1.3sRNA MarS

新体制运行以来，省军区系统总体呈现向好向上的发展势头，但工作机制不顺畅、职责分工不明晰等问题仍然客观存在，一定程度上抑制了新体制活力，影响制约了省军区系统建设发展。

PAPPESCH等[32]在GAS M49591中报道了一种新型sRNA MarS (mga-activating regulatory sRNA)，与mgamRNA的5′UTR相互作用。它可以调节Mga依赖性毒力因子的表达，并影响荚膜的形成与透明质酸的生物合成，从而提高菌株毒力。与FasX调控化脓性链球菌定植方式不同，MarS通过增强细胞外基质结合表面蛋白(M protein、fibronectin-binding protein F1)的表达和刺激夹膜多糖(CPS)的合成而促进粘附，同时抑制细菌的传播。

2.2 肺炎链球菌(S. pneumoniae)

肺炎链球菌是一种条件致病菌，可导致感染、败血症、脑膜炎和心内膜炎等多种人类疾病，也是造成肺炎病人死亡的主要原因[53](表1和表2)。

2.2.1sRNA F20和F32

sRNA F20(srn157)和F32(tmRNA)主要与肺炎链球菌的毒力调节有关。F20和F32的缺失突变株均可减少肺炎链球菌对鼻咽或内皮细胞的粘附和侵袭，使其不适于在鼻咽和肺部环境下存活。在F20和F32缺失突变菌株中，许多蛋白质的基因表达谱和丰度均发生了显著变化。基于蛋白质组学分析，ACEBO等[36, 54]发现在F20缺失突变株中嘌呤代谢显著下调，但DNA合成和修复途径显著上调。因此，F20缺失对细菌毒力衰减具有多效性作用。KUMAR等[54]报道，F32突变株抑制了乳糖转运系统和磷酸转移酶系统(PTS)等代谢途径。F32突变体对细菌的致病性有重要影响，说明F32与细菌应激反应和致病性缺陷有关，并且在反转录系统(tmRNA/SmpB system)中起着核心作用[55-57]。但目前这两个sRNA与目标基因之间的具体调控机制尚未阐明。

2.2.2csRNA(cia-dependent small sRNAs)

csRNAs是链球菌中CiaR(Cia，Competence induction and altered cefotaxime susceptibility)调节的sRNA家族[58]。CiaR是CiaRH双组分系统(two-component regulatory systems，TCS)的响应调节因子，负责调节β-内酰胺敏感性、细菌素生物合成、细菌毒性和自溶作用。通过从14种链球菌菌株的基因组中寻找CiaR激活的启动子，揭示了51个长度为51-202 nt的csRNA，可分为40种不同类型[59]。在这些csRNA中，有5个肺炎链球菌csRNA，即csRNA1-5，是由CiaR调节子中ccnA-E(cia-controlled non-coding RNA，ccn)转录而来。HALFMANN等[58]报道了csRNA4和csRNA5参与肺炎链球菌R6的固定相自溶(stationary-phase autolysis)。微阵列分析(microarray analysis)发现，csRNA1的失活表明其对邻近基因mRNA的顺式调控作用，也表明csRNA1在D39菌株中以共转录的形式存在[39]。但敲除或过表达csRNA1不影响细胞生长、应激反应、整体转录和毒力。

2.3 变形链球菌(S. mutans)

2.3.1sRNA L10-leader

XIA等[60]预测出334个sRNA，并验证L10-Leader的功能。L10-Leader在酸性环境中上调，表明L10-Leader与靶mRNA的结合可能增强了靶mRNA的稳定性并促使其翻译。这使细胞能够快速适应酸性环境，并确保在各种环境胁迫下DNA正确匹配。但L10-Leader在酸性条件下具体的调控机制尚未阐明。

2.3.2sRNA133474

ZHU等[41]发现变形链球菌UA159和其他临床分离菌株在不同pH环境(pH=5.5和7.5)中，存在9个与耐酸性相关的sRNA。其中，sRNA133474在pH=5.5时显著下调。研究表明，变形链球菌双组分系统中的liaS、liaR、comE、covR和ciaRmRNA与调节变形链球菌耐酸性相关，而sRNA133474通过抑制liaR、ciaR和covRmRNA的表达来调节变形链球菌的耐酸性。

2.4 猪链球菌(S. suis)

猪链球菌2型菌株主要可以引起猪的各类疾病，也能直接感染人体导致听力丧失、脑膜炎和败血性休克[62]。ZHANG等[43]在猪链球菌2型 P1/7(参考株)、98HAH33(高毒力分离株)和05ZYH33分离菌株中使用RNA-sequencing预测了56个sRNA，部分sRNA与细菌毒力和核糖开关(riboswitch)有关。三种菌株中都检测到sRNA rliD和RatA，另外98HAH33和05ZYH33菌株含有sRNA cspA和rli38。sRNA rss04已被证实可抑制P1/7中荚膜多糖(CPS)的生物合成[44]，从而增强猪链球菌2型菌株在小鼠脑微血管内皮细胞的粘附和侵袭能力。此外，rss04还可以通过调节CcpA和LuxS来影响生物膜的形成和CPS的生物合成[63-65]。但目前尚未具体描述sRNA的作用机理(表1和表2)。

3 链球菌sRNA调控是否依赖Hfq蛋白？

Hfq(也称为HF-1)是一种RNA伴侣蛋白，广泛存在于革兰氏阴性和阳性细菌中，在大肠杆菌Qβ噬菌体RNA复制时所需的重要宿主因子[65]。Hfq具有至少三个不同RNA结合表面，是一种环状同源六聚体蛋白[6]。生物信息学和晶体结构分析表明，Hfq与真核生物中的Sm和类Sm(LSm)蛋白具有高度同源性，因此也称为类Sm蛋白[66, 67]。在革兰氏阴性细菌中，sRNA和目标mRNA相互作用必需Hfq的参与[68-70]。例如，在大肠杆菌中Hfq是sRNA转录后调控的核心。尽管sRNA调控对Hfq的需求取决于多种因素，但Hfq可促进大多数细菌sRNA与目标mRNA的配对，并参与调节RNA的翻译加工、稳定性和多聚腺苷酸化[71]。

虽然部分革兰氏阳性细菌中也存在Hfq同源蛋白，但迄今为止革兰氏阳性细菌中已知依赖Hfq的sRNA，仅报道单核细胞增生李斯特氏菌的LhrA[72, 73]。根据比较基因组学分析，在已知的链球菌中尚未发现Hfq及其同源蛋白[74]。因此，我们认为链球菌sRNA调控不依赖Hfq及其同源蛋白的参与。

4 存在问题与展望

尽管在链球菌中已经预测并鉴定了一些sRNA，但目前大部分链球菌sRNA研究集中在对化脓性链球菌FasX、Pel、RivX和MarS及肺炎链球菌F20和F32等毒力调控。在链球菌中对响应pH，氧气和营养素等环境变化的sRNA研究非常有限。此外，由于缺乏对作用方式和靶标鉴定的研究，目前对链球菌中sRNA调控的认识有限。大量其他细菌中已报道的sRNA及其调节机制也尚未在链球菌中证实。因此，链球菌中还存在大量的未知sRNA亟待研究。

sRNA介导的基因抑制是利用天然sRNA为骨架，合理设计人工合成sRNA，使细胞在染色质基因不被改变的情况下实现基因抑制。此技术已广泛应用于大肠杆菌[75]和枯草芽孢杆菌[76]等模式菌株的代谢工程中。人工合成sRNA已应用于枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性细菌，但能否应用于链球菌的基因调控，例如能否用于链球菌中改善胞外多糖等各种天然产物的生物合成？尽管目前对链球菌sRNA人工设计还存在疑问，但通过对sRNA及其调控的深入研究，我们相信链球菌sRNA必将能够作为一种简单、有效的新型代谢工程和合成生物学遗传工具。