零热量甜味剂D-阿洛酮糖的研发进展

黄擎宇， 徐 铮*， 熊 强， 张 倩， 李克文， 徐 虹

1.南京工业大学食品与轻工学院 材料化学工程国家重点实验室，江苏 南京 211816；2.保龄宝生物股份有限公司，山东 禹城 251200

目前，世界范围内的肥胖、糖尿病、高血压和高脂血症等体重过度增加相关疾病的患病率和发病率显著增加，而高脂肪高热量食品是导致这种情况的主要原因。在中国这一现象尤为严重，肥胖患者与糖尿病患者数量已接近2亿，并呈现出低龄化趋势。在这一环境下，人们越来越重视食品的安全性和对人体健康的影响。低热量、具备多种功能的食品因此在市场上越来越受到消费者欢迎，对此类食品的研究与开发成为了国内外学者的关注重点。D-阿洛酮糖是一种自然界存在极少的稀有糖，由于其对健康的益处，许多团队陆续开始对其在功能性食品领域的研究与开发进行研究。

1 D-阿洛酮糖简介

1.1 物理化学性质

D-阿洛酮糖(D-psicose/D-Allulose)是一种稀有糖，甜度为蔗糖的70%[1]，作为碳水化合物的不可发酵组分以及作为农产品中的游离糖存在。D-阿洛酮糖为白色粉末状晶体，溶于水、甲醇、乙醇等，是D-果糖的C-3差向异构体(见图1)，IUPAC名为(3R,4R,5R)-1,3,4,5,6-pentahydroxyhexan-2-one。D-阿洛酮糖化学式为C6H12O6，摩尔质量为180.156 g/mol，熔点为109 ℃，PSA118.22，CAS号551-68-8。安全性方面，D-阿洛酮糖已在2014年通过了美国FDA安全认证，2015年获得了GRAS的认证[2]。

图1 D-阿洛酮糖和D-果糖的化学式

1.2 现有来源

自然界中天然存在的D-阿洛酮糖含量极少，来源于少部分植物和少数细菌。2006年，香川大学IZUMORI团队测定了日常生活中不同食品的D-阿洛酮糖的含量并公布了部分数据[3](见表1)。他们在实验中发现，各种食品中的D-阿洛酮糖含量与制糖过程中的糖浓度，温度和加热时间密切相关。

表1 不同食品中的D-阿洛酮糖含量[3](μg/g)

1.3 功能性

日本科学家TAKATA等[4]通过建立并研究神经毒素6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamin,6-OHDA)诱导嗜铬细胞瘤细胞凋亡的体外帕金森氏病模型，发现D-阿洛酮糖对于细胞凋亡的抑制展示出了特殊效果,说明其可以起到保护神经的作用。在治疗神经变性疾病时，由于D-阿洛酮糖可促进内谷胱甘肽的增量调节，因而有望作为保护剂进行研发。

相对其他稀有糖，D-阿洛酮糖能更加有效地清除活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)和抑制其产生的能力[5]，对先天免疫系统具有保护作用，这种功能对于防治多种疾病具有潜在的价值。例如D-阿洛酮糖能够抑制ROS在睾丸组织中产生，从而阻止由di-(2-eth-ylhexyl)phthalate(DEHP)诱导的睾丸损伤，同时对氧化剂介导的睾丸损伤起到保护作用。由于对前炎性细胞活素有抑制作用，D-阿洛酮糖可以使炎性反应中断起到抗炎效果[6]；通过调节p38-促分裂原活化蛋白激酶(p38-Mitogen-Activated Protein Kinase)，单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)的表达可被D-阿洛酮糖抑制，这在动脉粥样硬化治疗时可以发挥作用[7]。

D-阿洛酮糖的甜度在相当于蔗糖甜度的70%的同时几乎不含热量，在美国被称为最具潜力的蔗糖替代品。IZUMORI团队[8]2006年的小鼠实验表明了相较于摄入其他糖类的小鼠组，摄入D-阿洛酮糖的小鼠血糖水平均比较低，后经分析得知D-阿洛酮糖可以通过对脂肪肝酶和肠道α-糖苷酶的抑制，从而降低小肠对糖类的吸收速率来减少体内脂肪的积累并抑制血糖浓的上升，可以用于对糖尿病Ⅱ型的治疗[9]。在日本自治医科大学的研究人员发布的一项小鼠实验的结果中[10]，他们通过实验发现D-阿洛酮糖可以促进“GLP1”的分泌，而GLP1可促进胰岛素分泌、抑制食欲，能有效治疗糖尿病。此外，HAYASHI和IIDA等人[11]通过临床试验结果证明了日常饮食中添加D-阿洛酮糖能降低餐后血糖水平，以及提高胰岛素的敏感性和葡萄糖耐受性，大部分D-阿洛酮糖在小肠中被吸收并通过尿液从体内排泄出去。

除了医疗价值，D-阿洛酮糖的口感和甜度与蔗糖相近，作为一种功能性甜味剂还能够弥补传统的甜味剂的不足，可以改善食品的风味、色泽、外观和口感，具有延长货架期等作用[12]。添加了D-阿洛酮糖的食品的胶凝度不仅可以得到提高，其风味也能够被改善。同时D-阿洛酮糖还可以和食品蛋白发生美拉德反应[13]可以形成较好的交联结构，改善食品质构，并使食品在抗氧化性方面也有所提升[14]。在食品的加工中，利用D-阿洛酮糖与蛋白的美拉德反应制成的功能性食品和特医食品可对某些特定疾病进行防治，例如预防由氧化应激导致的疾病、抗龋齿等[15]。

D-阿洛酮糖对植物也有一定影响。香川大学农学研究所的研究人员称发现了几种稀有糖诱导水稻等害虫防御相关基因的表达，同时他们正在研究稀有糖对调节植物生长的作用，以及用于抗病诱导和生长调节的材料的开发[16]，而D-阿洛酮糖就包含在这些稀有糖中。

2 D-阿洛酮糖的合成生产研究进展

2.1 化学法制备技术

阿洛酮糖的研究到今天约有28年的历史[17]。迄今为止，D-阿洛酮糖的制取有生物合成法和化学合成法两种。首先讨论的是化学合成法，在2017年授权的一项专利(授权公告号：CN104447888B)[18]中，研究人员主要采用化学方法，选取价格较为低廉的葡萄糖作为原料，选择无机材功能料钼酸盐作为催化剂，在80 ℃～120 ℃加热后经催化转化、分离提纯得到产物D-阿洛酮糖。产物通过有机溶剂法进行降温结晶得到的D-阿洛酮糖产品，其含量可达98.5%～99.5%。相较于生物酶法生产D-阿洛酮糖出现的转化效率低，反应慢、耗时长的问题，化学合成法的优势十分明显。但化学合成存在着纯化步骤较复杂，会产生化学废料和无价值副产物等问题[19]，同时化学合成甜味剂甜味往往不够纯正，此法的产物与天然存在的D-阿洛酮糖口感是否存在差距还有待考证。并且化学合成法的应用并不广泛[20]，D-阿洛酮糖实际上难以化学合成[21]。

2.2 生物法制备技术

2.2.1菌种和酶

酶作为催化剂在精细化学品制造和食品加工等不同领域占有重要地位[22]，当今世界上生产D-阿洛酮糖的主要方法是以酶作为催化剂的生物合成法。在国外，日本香川大学的IZUMORI, YAMAKITA等人[17]1990年从菊芋假单细胞菌(Pseudomonascichorii)中分离纯化得到D-塔格糖-3-差向异构酶(D-tagatose 3-epimerase,DTEase)，首次描述了以D-塔格糖等为底物用生物方法合成D-阿洛酮糖的过程,并根据用于表征细菌的标准试验中的菌株的结果将该生物体表征为产碱菌属(Alcaligenessp.701 B)。这次的探索象征着D-阿洛酮糖生物转化生产的开始，该转化法也属于后来提出的Izumoring法[23]。目前，已经被发现并表征的可用于D-阿洛酮糖生物法合成的生物催化剂有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-psicose 3-epimerase,DPEase) 和D-塔格糖-3-差向异构酶，并且大多数情况选择D-果糖通过这两种酶催化转化来制取D-阿洛酮糖。已发现可产生DTE酶的菌种有菊芋假单细胞菌和类红球细菌[24](Rhodobactersphaeroides)等；DPE酶的来源较多，包括根癌土壤杆菌[25](Agrobacteriumtumefaciens)、解纤维梭菌[26](Clostridiumcellulolyticum)、瘤胃菌[27](Ruminococcussp.)、梭状芽孢杆菌[28](Clostridiumbolteae)、梭菌属[29](Clostridiumsp.)和螺旋梭菌[30](Clostridiumbolteae)等。

在使用过程中，酶的保存是极为重要的一环，能够延长酶的储存寿命并保持稳定性是将其投入商业应用的基础。江南大学的研究人员通过对比不含添加剂的DPE酶与加入一些常用的提高酶稳定性的化学添加剂的DPE酶在15 d和30 d后的活性，得出结论MnSO4和乙二醇对于提高DPE酶的稳定性和储存有很大的帮助[31]。TSENG等人[32]发表了关于来源有Agrobacteriumsp. ATCC 31749的DPE酶研究成果的论文，文中提到他们发现ATCC 31749产出的DPE酶活性高于来源于根瘤土壤杆菌的DPE酶，除此之外还鉴定出残留N234作为重要的界面残基，对酶活性的影响极为显著。随着专家学者们越来越关注，有关DPE酶与DTE酶在保存、提高酶活等方面的研究也会成为D-阿洛酮糖研究中的热点。

2.2.2国内外发展动向

韩国CJ第一制糖株式会社和日本松谷化学工业株式会社是当今世界上生产D-阿洛酮糖主要的厂家[21]。松谷化学工业[33]主要是利用从不具有植物病原性的节杆菌(Arthrobactersp.ConnandDimmick)中得到的新型酮糖3-差向异构酶催化D-阿洛酮糖和D-果糖之间的互相转化，这与先前相比更适用于工业化生产。2011年授权的一项专利中，韩国CJ第一制糖株式会社[34]的研究人员克隆了源自根瘤土壤杆菌的DTE酶并表达，首次证明了只有源自根瘤土壤杆菌ATCC33970的DTE酶具有具有将D-果糖转化为D-阿洛酮糖的能力(图2)。

图2 简易工艺流程图

D-果糖和D-阿洛酮糖之间的转化是可逆反应，如果能够使反应平衡朝着生成-阿洛酮糖的方向移动，即可大幅度提高转化率。2008年，韩国世宗大学Oh团队[35]实验发现，随着硼酸盐的加入，平衡逐渐向D-阿洛酮糖方向移动，当硼酸盐与D-果糖的摩尔比达到0.6时达到最大转化率，约为无硼酸盐加入时的两倍。研究人员解释为由于硼酸盐对不同糖亲和力不同，其对D-阿洛酮糖的亲和力要高于对D-果糖，因而与D-阿洛酮糖结合形成D-阿洛酮糖-硼酸盐复合物，且形成的复合物不参与反应。

重组后的大肠杆菌细胞生产效率明显提高，非常适合用于D-阿洛酮糖的生产。但大肠杆菌是一种潜在病原菌[36]，不是公认的安全菌株，且产物多为包涵体，在食品及医药等行业的使用受到限制。2016年，Oh团队在将D-果糖转化为D-阿洛酮糖时尝试了用GRAS菌株谷氨酸棒状杆菌作为宿主表达DPEase基因，研究不同pH，温度，金属离子和细胞及底物浓度等条件对反应的影响，发现金属离子Co2+对提升酶的活力的作用最为明显。此外，谷氨酸棒状杆菌经过透化后在优化条件下进行反应，通过Bio-LC系统(Dionex ICS-3000,USA)用电化学检测器和CarboPac PA10色谱柱测定单糖浓度。分析得到，10 g/L透性细胞可使750 g/LD-果糖产生235 g/LD-阿洛酮糖，转化率达到31%(w/w)，是非透性细胞的1.4倍[37]。

在国内，江南大学江波团队[23]在2008年对鱼塘淤泥、水样中富集分离的细菌进行分析筛选，得到一株转化率较高的类红球细菌(RhodobacterphaeroidesSKO11)，其产率达到6.54%。2011年该团队以微生物ClostridiumcellulolyticumH10的基因为模板，通过基因合成成功获得了DTE的编码基因，并采用1 mmol/L的IPTG在28 ℃下诱导6 h后在大肠杆菌中成功表达[26]。天津工业生物技术研究所研究人员柏玮等人[38]将来源于ClostridiumcellulolyticumH10的DPE基因与根癌土壤杆菌的DPE基因比对发现两者相似度为60%，同样可以催化D-果糖和D-阿洛酮糖的互相转化。该方法中，经过在37 ℃下培养16 h后得到的ClostridiumcellulolyticumH10的基因在枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中进行表达，采用粗提取、亲和层析、离子交换色谱三步方法得到纯化的重组DPE蛋白，用其在50 ℃催化D-果糖1 h后反应达到平衡，D-果糖转化率为27.34%。

D-葡糖糖被广泛应用于制取D-果糖，为了获得更广泛的原料来源和降低成本，日本的研究人员在1995年就进行了以D-葡萄糖为底物转化D-阿洛酮糖的实验，但是转化率只有10%[39]。2016年，我国江波团队以D-葡糖糖为原料对D-阿洛酮糖的转化进行了更彻底的研究[40]。研究人员在Izumoring法的基础上，把D-果糖与D-葡萄糖偶联作为中间体，尝试从D-葡萄糖中获得D-阿洛酮糖。 其原理为先将D-葡萄糖通过D-葡糖糖异构酶(GIase, EC 5.3.1.5)转化为D-果糖，同时立刻用DPEase将转化出的D-果糖异构化为D-阿洛酮糖。研究发现在pETDuet-Glase/DPEase共表达系统中温度是影响反应的最主要因素，当处于65 ℃～75 ℃时系统高度活跃，相对活性保持在88%以上。当反应在最佳条件下达到平衡时，D-阿洛酮糖、D-果糖和D-葡萄糖的平衡比约为3∶7∶6.5[40]。研究人员还指出加入硼酸盐作为一种有效手段，有望帮助该体系转化率获得进一步提高。市场上D-葡萄糖比D-果糖更为常见且价格更为低廉，D-葡萄糖作为原料可以大大减少生产成本，这一方法为以D-葡萄糖为原料转化D-阿洛酮糖的工业化生产提供了实践依据。

3 D-阿洛酮糖的分离纯化

以D-果糖为原料的生物法生产D-阿洛酮糖的产物为D-阿洛酮糖和D-果糖的混合物，并且D-果糖占产物的大部分，因此如何从混合物中分离纯化出D-阿洛酮糖具有重要意义。

2000年，香川大学IZUMORI团队在制取D-阿洛酮糖时为了从混合物中分离出D-阿洛酮糖，选择了在发酵D-果糖时使用面包酵母而不使用柱层析。研究人员将反应产物在有氧条件下在40 L的罐子中用面包酵母处理24 h后，HPLC图像显示D-果糖已被全部降解，再在35 ℃下真空蒸发使上清液浓缩为糖浆后使用乙醇沉淀纯化结晶，60 d内可获得约20 kg的D-阿洛酮糖晶体。这种方法的优点十分明显，简单的操作和低廉的成本并可节省大量劳动力，使得其具有应用于大规模生产并处理D-阿洛酮糖的潜力[41]。

虽然使用面包酵母的分离方法具有一定优势，但实际情况中例如长时间的细菌污染等问题的影响使其的应用仍未普及。目前，模拟移动床(SMB)工艺是世界上工业生产中分离时常用的手段，其固定相和流动相的有效使用以及操作的连续性有助于减少溶剂的消耗和促进生产率的提高。韩国仁荷大学的研究人员使用装有Dowex 50WX4-Ca2+离子交换树脂的四柱模拟移动床，基于三角理论设计并模拟了分离D-阿洛酮糖和D-果糖的SMB过程，最终在稳态下分离出的D-阿洛酮糖纯度达到99.36%[42]。该结果证明了SMB方法(图3)的实用性，并为工业大规模处理含有D-阿洛酮糖混合物的进一步研发奠定基础。

图3 SMB流程简图[42]

离子交换树脂分离作为制糖工业中常用的分离方法，江南大学的研究人员在2011年采用该方法对不同条件下D-阿洛酮糖的分离效果进行了测定，实验得出进样量10 mL，柱温60 ℃，填料体积400 mL，去离子水为流动相，流速1 mL/min时为最佳分离条件，在此条件下可获得纯度为98.3%的D-阿洛酮糖[43]。

4 D-阿洛酮糖应用前景

2014年，世界卫生组织(WHO)发布了《成人和儿童糖摄入量指南》，该指南建议人们对“游离糖”摄入最好不超过总能量摄入的5%[44]，而这里所指的“游离糖”即传统甜味剂如蔗糖、果糖等。2015年，我国甜味剂年产量由2010年的9.3万吨达到了15.4万吨，每年都在稳定增长。与此同时，新型甜味剂在2016年也已经占据了市场规模的约82%。因此，具有特殊功能，有益健康的D-阿洛酮糖有着极为广阔的前景。

D-阿洛酮糖对于食品的风味、色泽、外观、口感进行改善的作用，可以用于冰激凌，巧克力等一些诱人但易发胖的食物中，一方面保证口感的同时降低热量减少发胖的担忧，另一方面可增加食品的销量；也可以代替薯片，口香糖等日常零食中的阿斯巴甜，做到更加安全卫生，并减少食品的加工和贮藏中的氧化损失[45]。除了日常食品中可加入D-阿洛酮糖外，将其做成特医食品也是很好的选择，针对糖尿病人、肥胖症患者等人群，做成的食品可以帮助抑制血糖升高和减少脂肪在身体内的积累。D-阿洛酮糖对于神经系统的保护作用使其可以作为保护剂制成神经保护类药物、保健品等；同时在清除ROS、抗龋齿和应对氧化应激导致的疾病中的突出表现令其也具有被开发成药物的潜力。此外，D-阿洛酮糖对于植物的特殊作用，例如防虫害等，如果在日后能够研究彻底并制造出对人类和环境都有利的农业材料也将具有重大意义。“民以食为天,食以安为先”，在食品安全日渐突出的今天，低热量、具备多种功能的食品会逐渐成为人们的主要食品。D-阿洛酮糖作为一种出色的功能性甜味剂，必定可以在未来的食品等行业发挥巨大作用，为改善人民生活水平做出贡献。