一株抑制单增李斯特菌感染的S. epidermidisG26菌株的分离筛选

郭 亮，张闻桐，闫帅帅，李孟华，刘 箐*, 文 一

1. 上海理工大学医疗器械与食品学院， 上海 200093; 2. 生态环境部环境规划院， 北京 100012

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes，Lm)，简称单增李斯特菌，是自然界中普遍存在的一种微生物，广泛分布在各种环境中，人类通过摄入感染Lm的食物等发生李氏杆菌病[1]。李氏杆菌病主要影响免疫力低下的老年人、孕妇和新生儿，致死率可达到20%～30%[2]。在具有免疫缺陷的宿主例如老年人或接受免疫抑制疗法的病人体内可以表现为败血症或脑膜脑炎，通过胎盘感染婴儿表现为孕妇流产、死产[3]。不管是人类还是动物，Lm可感染多种组织，包括脾、肝和脑，一般认为Lm穿过肠道屏障进入淋巴和血液，在肝细胞或脾细胞中复制并在巨噬细胞和上皮细胞内进行繁殖，然后通过血液可以到达大脑和胎盘[4, 5]。

随着新型检测技术的出现和应用，Lm在食品中的检出率大大提高，污染控制已得到极大的改善，但Lm污染导致人畜患病仍常有发生。Lm感染人体后，以抗生素治疗为主，氨苄西林或氨苄青霉素是最佳首选药物，对于青霉素过敏的患者使用复方新诺明[6]。传统抗生素通常是抑菌或杀菌的，这意味着它们杀死或阻止病原菌的同时也会不可避免的杀死有益微生物，而抗生素的滥用也会带来新的问题—病原菌耐药菌株的形成、药品不良反应以及生态环境的破坏等[7]。因此，寻找一个能够预防和治疗Lm的新方法已经迫在眉睫。

肠道菌群、宿主和病原菌的最新研究给我们带来了新的思路，不同的肠道菌群组成能够抵抗或者协助病原菌的入侵[8]。用抗生素或在无菌环境中繁殖的小鼠更易受到肠道病原菌感染，如Shigellaflexneri、Citrobacterrodentium、Lm和SalmonellaentericaserovarTyphimurium等[9, 10]。已有研究证明肠道微生物的代谢产物丁酸能够有效抑制沙门氏菌的入侵，将成熟母鸡体内的肠道菌群定植到刚孵化小鸡体内被证明确实能够有效降低沙门氏菌的感染，减少小鸡体内免疫炎症的发生[11]。Lm的粘附蛋白(Listeria adhesion protein, LAP)能够增加促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达来诱导肠上皮屏障功能发生障碍，从而促进Lm的感染 。而肠道菌群的代谢物色胺(tryptamine)和吲哚-3-乙酸(indole-3-acetate,I3A)可以降低巨噬细胞炎症指标，减少促炎性细胞因子的生成和抑制细胞向趋化因子迁移[12]。那么，能否利用健康宿主的肠道微生物抵御Lm的入侵甚至改善或治疗Lm感染人体后造成的相关疾病或死亡？本研究对健康小鼠粪便中的肠道菌群进行筛选、分离和培养，并通过动物实验证明了分离株G26能够降低单增李斯特菌感染小鼠的死亡率，以期为治疗和预防单增李斯特菌感染提供一种治疗方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株、培养基和实验动物

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)野生株EGDe来自华中师范大学罗琴教授赠送；6～8周龄的SPF级BALB/c雄性小鼠购买自上海杰思捷实验动物有限公司，在实验室动物房适应性饲养1周后用于实验，所有饮水和饲料均已灭菌。

脑心浸液培养基(Brain Heart Infusion，BHI)购自北京路桥技术股份有限公司，称取37 g粉末溶于1 L去离子水中，高压灭菌(121 ℃，15 min)后使用；固体BHI培养基在液体培养基中添加1.5%的琼脂粉，高压灭菌(121 ℃，15 min)；李斯特菌显色培养基(CHROMagar Listeria)购自上海欣中生物工程有限公司，称取51.5 g基础培养基溶于1 L去离子水中，高压灭菌(121 ℃，15 min)并暂存至50 ℃烘箱，取增补剂9 g加入40 mL无菌水中磁力搅拌(700r/min～1 000 r/min)30 min，混匀后倒入基础培养基中并混匀，立即倾注平皿，凝固晾干后备用。

1.1.2试剂

琼脂粉、氯化钠(NaCl)、无水磷酸氢二钠(Na2HPO4)、氯化钾(KCl)、磷酸二氢钾(KH2PO4)购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3仪器

漩涡震荡仪(Vortex-Genie2)购自Scientific Industries公司；生化培养箱(LRH-70)购自上海一恒科学仪器有限公司；纯水仪(明澈-D 24 UV)购自Millipore公司；厌氧培养箱购自Ruskinn公司。

1.2 方法

1.2.1小鼠粪便收集

将小鼠单独放置在酒精消毒的小盒内自由排便，镊子过火后收集粪便至1.5 mL无菌EP管内，EP管放置在冰盒内保持低温，收集好的粪便加入无菌PBS中匀浆处理，1 000 r/min离心5 min，收集上清用于后续实验。

1.2.2单菌落的分离和筛选

粪便上清进行适当的梯度稀释后涂布于BHI平板上，37 ℃厌氧箱内培养48 h，挑取形态不同的单菌落接种于BHI液体培养基中，经过重新划线纯培养后，进行甘油菌冻存[13, 14]。

分离出的单菌在BHI液体厌氧培养48 h后，6 000 r/min离心5 min收集菌体，梯度稀释到菌浓度为(7～15)×107CFU/mL(涂平板计数得到)；单增李斯特菌EGDe接种于BHI液体37 ℃培养24 h后，6 000 r/min离心5 min收集菌体，梯度稀释到菌浓度为106CFU/mL。取96孔细胞培养板，共同加入200 mL BHI液体培养基、10 mL分离得到的单菌、10 mL EGDe，37 ℃培养3 h和6 h后，对培养基内的EGDe进行涂平板计数，EGDe单独添加作为对照。对有抑制效果的分离菌进行测序鉴定。

1.2.3分离菌株鉴定

分别使用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增分离菌16 s基因序列，得到的DNA片段进行产物纯化后送华大基因测序公司进行测序，测序结果使用DNAman软件进行拼接并使用NCBI进行BLAST，并使用Clustal 2软件和MEGA 7软件进行作图分析。

1.2.4动物实验

20只小鼠灌胃接种1×1011CFU/只的EGDe，PBS灌胃小鼠作为对照。灌胃接种1 d后，使用分离菌进行灌胃治疗，治疗剂量选择2×108CFU/只，连续治疗5 d。每天记录小鼠死亡数量，并在治疗后1 d、3 d、5 d和7 d取所有存活小鼠粪便进行稀释涂平板计数EGDe。在感染后第9 d麻醉脱颈处死所有存活小鼠。所有动物实验均按照中华人民共和国国务院批准的《实验动物事务管理条例》进行。

2 结果与分析

2.1 分离菌抑制Lm生长

四株分离菌分别与EGDe共同培养后的两个时间点对EGDe的菌落计数结果见图1。与其他三株菌相比，G26菌株在3 h的共同培养中已经与EGDe单独培养组出现显著性降低差异(P<0.05)，在共同培养6 h后差异更为显著(P<0.01)。此外，G6菌株在6 h培养后与E组相比也出现显著性差异。最终，选择G26作为后续实验菌株使用。

注：对96孔板内的Lm进行计数，所有数据使用Student’s t test进行显著性分析，*=P<0.05, **=P<0.01。

图1 分离菌抑制Lm生长

2.2 分离菌G26鉴定

分离菌测序BLAST结果见表1。G26基因序列在NCBI进行序列比对后，G26的16S rDNA序列与葡萄球菌属的16S rDNA序列相似度高达99%。通过软件MEGA.7.0计算得出进化树可知，菌株G26为表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)(图2)。分离菌株G26的生物学分类和一般特征见表2。

表1 G26与葡萄球菌属模式菌株BLAST结果

表2 G26生物学分类和一般特征

2.3 动物实验

2.3.1G26治疗EGDe感染BALB/c小鼠生存率

分离株G26灌胃治疗感染小鼠生存率见图3。在Lm感染后72 h小鼠开始出现死亡。与PBS治疗相比，G26组小鼠在感染后第4 d没有出现小鼠死亡。一直到第8 d，G26组小鼠死亡的数量比PBS组小鼠少3只，生存率高15%。从结果可知，分离株G26能够降低感染小鼠的死亡率。

2.3.2G26治疗EGDe感染BALB/c小鼠粪便计数

G26治疗EGDe感染BALB/c小鼠粪便计数结果见图4。治疗1 d后，两组小鼠粪便内的Lm含量没有显著性差异，所有小鼠粪便内Lm含量均在1×106CFU/g～1×106CFU/g左右。在治疗后第3 d、5 d和7 d两组的Lm含量分析仍没有显著性差异，但是G26组粪便内Lm含量呈现出低于PBS组的趋势。可能原因是由于在治疗后，两组小鼠的死亡数量不同，肠道内高含量Lm的小鼠可能已经死亡，导致出现误差。此外，在第7 d两组出现部分小鼠体内无Lm检出，这也可能是造成没有显著性差异的原因之一，因势。可能原因是由于在治疗后，两组小鼠的死亡数量不同，肠道内高含量Lm的小鼠可能已经死亡，导致出现误差。此外，在第7 d两组出现部分小鼠体内无Lm检出，这也可能是造成没有显著性差异的原因之一，因此，接下来分析了小鼠粪便内Lm检出率。

注：图2展示了分离菌G26与其他与其他亲缘关系密切的菌株的位置关系。括号内为Genbank编号，使用Clustal 2对序列进行比对，并在MEGA 7软件中用最近邻居法(Neighbor Joining)进行系统发育推断。比例尺代表0.002%的核苷酸序列差异。

图2 G26系统发育树

注：每个点代表对应分组内对应时间点的小鼠存活率。第一阶段：Lm感染阶段；第二阶段：灌胃治疗阶段；第三阶段：不作任何处理，观察阶段。

2.3.3第7 d存活小鼠粪便内Lm检出率

第7 d存活小鼠粪便内Lm检出率见图5。粪便内Lm技术方法为涂平板计数，因此，计数方法会存在一个检出线，在设置的浓度梯度中，最低检出线为1×104CFU/g ，低于这个浓度的Lm无法被平板计数检出。在小鼠感染第7 d后，部分存活小鼠体内的Lm被清除。分析了两组小鼠检出率，与PBS组相比，G26组小鼠未检出的数量更多，高于PBS组10.3%。因此，分离株G26能够清除小鼠体内的Lm从而治疗感染小鼠。

3 结论

健康人群和小鼠对口服Lm感染具有很高的抵抗力，肠道菌群作为宿主的第一道防线，在抵抗Lm入侵方面发挥着重要作用[15]。通过抗生素处理或者饮食等扰乱肠道菌群秩序会降低宿主对Lm的抵抗能力。而使用SPF级大鼠粪便治疗Lm感染小鼠后，可以显著降低大鼠体内Lm的载菌量。本研究通过从健康小鼠粪便中分离肠道菌群，并通过体外试验和动物实验验证分离菌治疗Lm的治疗效果。分离株G26体外能够有效抑制Lm的生长、降低感染小鼠死亡率和清除感染小鼠肠道内的Lm数量等，表明分离株G26能够有效治疗Lm感染小鼠。

图5 第7 d存活小鼠粪便内Lm检出率