两种价态铬(Ⅲ，Ⅵ)对真核酵母细胞谷胱甘肽水平影响

陈冉冉，朱 倩，赵 敏，黄志伟

东华大学化学化工与生物工程学院，上海 201620

在工业化进程中，重金属得到广泛使用并越来越多地释放到环境中。重金属难以用生物化学方法降解，能够通过食物链积累从而威胁人类健康[1]，因此全世界越来越关注重金属污染问题。国际上Cr是与Hg、Cd、Pb并列的四种主要污染物之一[2]。环境中铬的主要存在形式为：Cr6+和 Cr3+。Cr6+是铬发挥毒性的主要形式，并在1987年被国际癌症研究机构(IARC)确认为人类致癌物[3]。在铬酸盐制造、镀铬、铬铁生产和不锈钢焊接过程中，Cr6+出现的频率较高[4]。通常认为Cr3+低毒，在调节血糖水平中起着重要的作用[5]，三价铬盐，包括氯化铬、烟酸结合铬、聚烟酸铬和吡啶甲酸铬，被用作微量营养素和膳食补充剂[6]。但Cr3+作为必需微量元素仍存在争议[7]，KSHEMINSKA[8]和我们实验室[9]的研究结果都证实了Cr3+和Cr6+对活细胞都是有害的，在一定浓度下酿酒酵母对两者的积累效率是基本相同的。

重金属引起氧化应激是非常普遍的[10]，铬也不例外，Cr能够引起氧化损伤发挥其毒性[11]，谷胱甘肽(GSH)是一种抗氧化剂，在保护细胞免受氧化剂和重金属引起的应激中起着重要的作用，是抵御自由基攻击的第一道防线[12]，GSH1是γ谷氨酰半胱氨酸合成酶基因，催化GSH生物合成的第一步，对于抵抗氧化应激和重金属解毒过程中不可或缺[13]。

微生物吸附处理重金属废水是一种经济有效的生物技术。酿酒酵母广泛用于食品和饮料生产中，容易使用廉价培养基进行培养，同时也是发酵工业的大量副产品，易于获得，且易于在分子水平上操作[14]。因此，本文以酿酒酵母为模型，检测了三价铬和六价铬对酵母生长的影响，并研究了不同价态的铬对酵母胞内谷胱甘肽含量影响。通过过表达GSH1来进一步验证两种价态的毒理机制不同，有望找到不同价态铬毒性的相关机理，为工业含铬废弃物防治和微生物治理环境铬污染提供合理的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

菌株：在该研究中使用的菌株主要是酿酒酵母SaccharomycescerevisiaeBY4741(MATa;his3Δ1leu2Δ0met15Δ0ura3Δ0)、gsh1Δ(BY4741gsh1ΔKanMX)；所用质粒为YEplac195-ADH1pr；大肠杆菌E.coliDH5α用于质粒扩增，以上均由本实验室提供。

培养基：菌株在YPD培养基(1%酵母提取物，2%蛋白胨和2%葡萄糖)或含有2%葡萄糖的完全合成(SC)培养基或酵母选择性营养缺陷培养基(SC-Ura培养基)，完全合成SC培养基中不加尿嘧啶，于30 ℃培养。根据实验需要，加入不同价态的铬盐至培养基中。

1.2 实验方法

1.2.1细胞死亡率测定

将野生型菌株接种于4 mLYPD培养基中过夜；将活化的细胞转移到4 mL不同浓度的CrCl3(150 μmol/L)、K2Cr2O7(150 μmol/L、300 μmol/L)和或不加CrO3(300 μmol/L)铬盐的SC培养基中，处理细胞24 h。取适量处理和对照菌液梯度稀释滴至YPD平板培养2 d～3 d，计数各组的单克隆数量，算出细胞死亡率。(对照为0，重复三次)。

1.2.2生长曲线[15]

将活化的细胞转到新鲜的SC液体培养基中，使其起始OD值为0.1，30 ℃,180 r/min震荡培养, 在一定的间隔时间内用分光光度计测定OD600的值, 绘制生长曲线分析酵母细胞的生长状况。

1.2.3谷胱甘肽(GSH)含量测定

依据实验室已建立的GSH含量测定方法[16]，从对照及CrCl3(150 μmol/L)、CrO3(300 μmol/L)、K2Cr2O7(300 μmol/L)处理过的酵母细胞中提取GSH，测定样品的GSH含量。

1.2.4GSH1基因过表达质粒构建

在GSH1上下游500 bp左右设计的包含两个酶切位点引物：PstI和KpnI，构YEplac195—ADH1pr-GSH1的质粒。GSH1：F’aactgcAGAAGAATAAAATGGGA CTCTTAG；R’ggggtaCCAATATTCTACGTGCTTGTTA。将重组质粒转化进大肠杆菌并测序确认后，分别转化到酵母BY4741和gsh1Δ菌株中，构建GSH1基因过表达菌株，在SC-Ura培养基上培养，进行斑点实验分析GSH1过表达对不同价态铬胁迫的影响。

1.2.5斑点实验

将活化的酵母细胞悬浮于10倍稀释的水中，取5 μL～10 μL菌液滴在对照或添加所需化合物的SC-Ura平板上(150 μmol/L CrCl3、300 μmol/L CrO3和300 μmol/L K2Cr2O7)在30 ℃培养箱中培养2 d～5 d，观察拍照。

2 结果与讨论

2.1 两种价态铬(Cr3+，Cr6+)对真核酵母细胞毒性不同

致死率数据显示出两种价态的铬对细胞的生长都有影响，见图1，150 μmol/L CrCl3和150 μmol/L K2Cr2O7处理后，三价铬引起细胞的致死率是低于六价铬的，300 μmol/L CrO3对细胞的致死率高达65%，300 μmol/L K2Cr2O7对细胞的致死率为55%，两种价态的铬引起的致死率有显著差异，说明两种价态的铬对细胞的毒性作用不同。而且同为六价铬，化合物形式不同，致死率也不同，铬的展现形式决定了其对细胞的毒性作用。

2.2 酵母胞内GSH含量和细胞生长之间的关系

以初始OD600为0.1转接过夜培养的BY4741，在不同时间点取样测OD600，并检测胞内GSH含量。图2显示了菌体浓度随时间延长而增大，GSH含量先增大后减小。从对数前期(3 h左右)细胞内谷胱甘肽升高的最明显，到菌体细胞生长进入对数期(6 h左右)胞内谷胱甘肽处于较稳定的高水平阶段，随后有下降趋势。因此在后续的实验中选取3 h、6 h两个时间点取样检测GSH含量。

2.3 三氯化铬(Ⅲ)对酵母胞内GSH含量影响

从图3看出，随着三氯化铬浓度的升高，BY4741胞内GSH含量基本不变。在50 μmol/L、150 μmol/L CrCl3浓度下，3 h和6 h细胞内的GSH含量基本一致。即使在300 μmol/L CrCl3的处理下，GSH含量与对照基本保持一致。说明Cr3+对胞内GSH含量影响不大。

2.4 三氧化铬(Ⅵ)对酵母胞内GSH含量影响

图4显示了随着三氧化铬浓度的升高，不管是3 h还是6 h处理BY4741，胞内GSH含量都呈现降低的趋势，300 μmol/L CrO3处理的3 h细胞中GSH含量与对照相比减少了约1/3。

图1 两种价态铬(Cr3+，Cr6+)对酵母细胞致死的影响

图2 24 h内BY4741细胞的生长状况和胞内GSH含量变化

图3 不同浓度的三氯化铬处理酵母3 h、6 h后胞内GSH变化

图4 不同浓度的三氧化铬处理处理酵母3 h、6 h后胞内GSH变化

2.5 重铬酸钾(Ⅵ)对酵母胞内GSH含量影响

随着重铬酸钾处理浓度的升高胞内GSH含量都呈现降低的趋势，见图5。半抑制浓度重铬酸钾(300 μmol/L K2Cr2O7)处理的细胞3 h或6 h，GSH含量仅约为对照的1/2，而且随着浓度的升高，下降趋势明显。这可能是由于重铬酸钾进入胞内后，Cr6+与GSH结合消耗了GSH，使得GSH总含量减少。而且Cr6+需要消耗胞内GSH还原为低价态，Cr3+则对细胞内GSH水平影响不大。

图5 不同浓度的重铬酸钾处理酵母3 h、6 h后胞内GSH变化

2.6 酵母过表达GSH1有利于提高细胞对Cr6+的抗性

在BY4741和gsh1Δ中过表达GSH1，如图6a，药物敏感性分析发现，过表达GSH1并没有增强150 μmol/L CrCl3处理下细胞的生长状况，而在300 μmol/L CrO3和K2Cr2O7的平板上，过表达GSH1明显增强了细胞对Cr6+的抗性。图6b检测了超表达菌株中GSH的含量，证明了GSH1基因成功导入并且的确过表达。图6c的生长曲线得到了与图6a相同的结果，过表达GSH1对三价铬没有回补效果，但能明显增加细胞对六价铬的抗性。图3、图4和图5从侧面也证实了这一点。这说明Cr3+和Cr6+的毒理机制不同，细胞对它们的解毒机制也不同。

a.过表达GSH1菌株对不同价态铬的敏感性测试

b.过表达菌株中GSH含量的测定

3 结论

本文探究了Cr3+和Cr6+都对酵母的生长造成损伤，铬化合物影响酵母生长的程度取决于铬的价态形式。Cr6+处理酵母细胞后胞内GSH含量有所下降，而Cr3+处理对细胞内GSH含量没有显著影响。超表达GSH1能够加强野生型(BY4741)和部分的恢复突变型(gsh1Δ)酵母细胞对Cr6+的耐受性，对Cr3+作用不明显，说明GSH在抵抗Cr6+中发挥重要作用。这对铬污染环境防治提供依据，为铬耐受植株和菌株的改造和选育奠定了基础，同时也为其他重金属污染的防治提供了参考。