原生质体紫外诱变选育高产抗菌脂肽菌株及其活性物质的研究

谢定刚， 丛丽娜， 李若凡， 赵 金， 何媛媛

大连工业大学 生物工程学院，辽宁 大连 116034

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是农业部允许作为饲料添加剂的两种芽孢杆菌之一，其突出的特征是能够产生耐热、抗逆的芽孢，在自然界分布非常广泛。它可以产生多种抗菌物质，其中抗菌脂肽是通过非核糖体合成途径产生的具有抗菌作用的脂肽类化合物[1-3]。由于其具有广谱、高效、安全无毒、不易产生耐药性，并可以被生物降解、不会导致残留引起环境污染等优点，目前抗菌脂肽在食品和化妆品行业、医药行业、农业等相关领域的研究和应用得到了广泛的重视[4-6]。

黄曲霉是日常生活中常见的病原真菌，易在谷类、豆类等粮食和坚果上生长，是粮油食品中最常见的霉菌之一。由于黄曲霉对生活环境要求不高，只需要有一点碳与氮就能生长繁殖，并产生致癌性很强的黄曲霉毒素，其对人体健康及畜牧业造成很大的威胁[7]。目前，在防治黄曲霉引起的粮食作物霉变主要以化学防腐剂为主[8]，但化学防腐剂引起的人体健康问题日渐突出，研究和开发新的天然防腐剂已成为当今急切的需求，而枯草芽孢杆菌所产抗菌脂肽中的杆菌霉素D组分是目前唯一从微生物中得到并且已经鉴定的具有抗黄曲霉毒性的活性物质[9-11]。因抗菌脂肽其对人体健康没有造成影响，因此，杆菌霉素D是目前替代化学防腐剂的热点研究物质[12]。

本研究所用的枯草芽孢杆菌是从大连海域海参肠道中分离获得，其发酵产物中的抗菌脂肽对水产养殖动物致病菌如副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌及日常生活常见的黄曲霉具有显著的抑制作用[13-15]。但从自然中分离出的野生菌株其抗菌脂肽产量较低，而对枯草芽孢杆菌采用原生质体紫外诱变育种的研究尚未见报道[16]。以原生质体作为紫外诱变育种材料，在没有细胞壁的保护下，细胞对紫外线更为敏感，而且原生质体再生过程中有一个优存劣亡的自然筛选作用，代谢旺盛的原生质体得以再生，从而提高了正突变率[17,18]。所以本研究采用原生质体紫外诱变育种的手段筛选出高产抗菌脂肽的诱变菌株。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1出发菌株和指示菌

出发菌株：枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)mutHS-301，由本实验室自主分离保藏的菌株(GenBank 数据库检索号：GQ466597)。

指示菌：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、副溶血性弧菌(Vibroparachaemolyticus)和黄曲霉菌(Aspergillus flavus)均由本实验室保存。

1.1.2培养基

LB培养基(g/L)：酵母浸粉 5.0，胰蛋白胨 10.0，NaCl 10.0，pH 7.2～7.4，121 ℃灭菌20 min。固体培养基添加17～18 g/L琼脂粉。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖 10.0，牛肉膏15.0，磷酸氢二钾 5.0，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

再生培养基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母浸粉 5.0，牛肉膏 5.0，NaCl 5.0，六水氯化镁 4.07，顺丁烯二酸2.32，甘露醇 91.1，琼脂粉17～18，pH 6.7，115 ℃灭菌30 min。

PDA培养基(g/L)：马铃薯 200，葡萄糖 20，琼脂粉 17～18，自然pH，115 ℃灭菌30 min。

1.1.3试剂

高渗溶液A：用0.05 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)配制1 mol/L 的NaCl溶液，115 ℃灭菌30 min备用。

溶菌酶溶液：用无菌高渗溶液A配制不同浓度的溶菌酶溶液，过水系0.22 μm膜，于-20 ℃保存备用。

1.2 实验方法

1.2.1菌株mutHS-301生长曲线的测定

从LB菌种斜面上取一环出发菌株mutHS-301接种至装有10 mL的LB液体培养基，在30 ℃，180 r/min摇床培养16 h ～18 h。按2%的接种量接种至装有100 mL的LB液体培养基中，在30 ℃，180 r/min的条件下摇床培养，每间隔2 h取样测定培养液的OD600值。

1.2.2原生质体的制备及条件优化

取对数生长中后期的细胞菌液于灭菌的离心管中，4 000 r/min离心15 min，弃上清液，用高渗溶液洗涤2次，离心并收集细胞。采用单因素实验法测定不同的溶菌酶浓度、酶解时间和酶解温度条件下对原生质体形成率和再生率的影响。选择最适酶解条件对收集的细胞进行酶解破壁，酶解后离心使原生质体沉淀，弃上清液。获得的原生质体用高渗溶液洗涤2次并离心，最后定容于高渗缓冲液中，通过平板菌落计数法调整原生质体浓度为105CFU/mL。

原生质体形成率 =(A-B)/A×100%

原生质体再生率 =(C-B)/(A-B)×100%

式中，A为酶解前LB培养基上的菌落数；B为酶解后LB培养基上的菌落数；C为酶解后再生培养基上的菌落数。

1.2.3原生质体紫外诱变处理

取制备好的原生质体悬浮液10 mL，置于直径为9 mm的无菌培养皿(内置磁棒)中，并在磁力搅拌下用紫外灯照射(功率15 W，照射距离30 cm)，照射时间分别为0 s、20 s、40 s、60 s、80 s、100 s、120 s，光恢复10 min。取不同照射时间的原生质体处理液，按10倍系列梯度稀释后涂布在高渗再生培养基上，30 ℃条件下恒温避光培养18 h～24 h。待长出菌落，进行活菌计数并计算原生质体紫外诱变的致死率。

原生质体致死率 =(D-E)/D×100%

式中，D为诱变处理前再生培养基上的菌落数；E为诱变处理后再生培养基上的菌落数。

1.2.4高产抗菌脂肽菌株筛选及其遗传稳定性测定

将经诱变后在再生培养基上生长的单菌落接种在LB固体培养基上划线，30 ℃培养12 h ～14 h。连续转接3代培养后，各菌株分别接种到做好编号的试管发酵液中，于30 ℃，180 r/min发酵培养48 h，离心收集上清液，采用牛津杯法测定发酵上清液对指示菌的抑菌圈直径大小。选取抑菌圈较大的诱变菌株进行传代培养，固体平板上连续转接培养9代，并进行隔代摇瓶液体发酵培养48 h，离心收集上清液，采用牛津杯法测定其对指示菌的抑菌圈直径大小，并与出发菌株作比较。同时用稀盐酸将上清液调至pH为2进行酸沉，离心收集沉淀物，再用甲醇抽提后过膜收集滤液，将滤液于40 ℃恒温旋蒸得到抗菌脂肽提取物。最后计算该诱变菌株抗菌脂肽产量的变化。

1.2.5制备型硅胶板纯化抗菌脂肽单组分及分析

以氯仿∶甲醇∶水∶氨水的比例为60∶30∶3∶3作为展开剂，利用薄层色谱法对抗菌脂肽提取物各组分进行初步鉴定，并采用制备型硅胶板(GF254)对抗菌脂肽提取物进行单组分分离纯化。称取适量抗菌脂肽提取物溶于1 mL甲醇中，用毛细管充分点样于制备型硅胶板上，在层析缸中经展开剂展开后，分别刮取同行分离单组分斑点的硅胶，用甲醇对硅胶中的单组分进行抽提，离心收集上清液，旋干后溶于1 mL甲醇。采用RP-HPLC对单组分进行分析检测，并测定各单组分对黄曲霉的抑制作用。

1.2.6抗菌脂肽提取物对黄曲霉菌菌丝生长的影响

分别取1mL不同浓度抗菌脂肽提取物加入到19 mL已融化并冷却至50 ℃左右的PDA培养基中，充分混匀后倒入无菌的培养皿中，制成分别含抗菌脂肽终浓度为0.20 mg/mL、0.18 mg/mL、0.16 mg/mL、0.14 mg/mL、0.12 mg/mL、0.10 mg/mL和0.08 mg/mL的系列培养基平板，以加入等体积无菌水的PDA平板作为对照(A)。用直径为9 mm打孔器沿外缘钻取在PDA培养基上已培养约48 h的黄曲霉菌落块，分别接种于上述已经凝固的含抗菌脂肽培养基平板中央，菌丝面朝下，置于37 ℃恒温培养箱内培养。待A组霉菌菌丝长至平板边缘，采用十字交叉法测量含肽培养基上的菌落直径，与对照组比较计算出不同浓度处理对该黄曲霉菌丝生长的抑制率。

菌丝生长抑制率=[(对照组菌落直径-含肽组菌落直径)/对照组组菌落直径]×100%

1.2.7抗菌脂肽提取物对黄曲霉孢子致死浓度的测定

分别取1mL不同浓度抗菌脂肽提取物加入到19mL已融化并冷却至约50 ℃的PDA培养基中，充分混匀后倒入无菌的培养皿中，制成分别含抗菌脂肽终浓度为1.0 mg/mL、0.8 mg/mL、0.6 mg/mL、0.4 mg/mL、0.2 mg/mL、0.1 mg/mL和0.05 mg/mL的系列培养基平板，以加入等体积无菌水的PDA平板作为对照(a)。取100 μL浓度为104CFU/mL黄曲霉孢子液涂布于各浓度梯度培养皿中，于37 ℃下培养。培养至第8 d时，即对照组(a)培养皿霉菌长满整个平板且产生大量孢子，以此时无霉菌生长的最小浓度培养皿为最小致死浓度。

2 结果与讨论

2.1 菌株mutHS-301生长曲线

本实验采用分光光度法对枯草芽孢杆菌mutHS-301生长曲线进行测定。通过图1可以看出菌株的生长经历了延滞期、对数生长期、稳定期几个阶段。对数生长期大概在培养时间为2 h～14 h之间，此时期的菌体繁殖迅速，DNA复制频繁，菌株生长代谢较为旺盛及细胞壁对破壁酶较为敏感，形成的原生质体对紫外线等物理因子的刺激较为敏感且较为容易长出细胞壁而得到再生，所以本实验选择处于对数中后期10 h的菌株作为研究对象。这样既保证诱变实验时健壮的菌体细胞足够多以增加变异细胞的细胞总数，又可以减少分离性表型延迟现象的发生，从而使得诱变结果突变率较高且重现性较好。

图1 枯草芽孢杆菌mutHS-301生长曲线

2.2 原生质体的制备和再生

(1)酶解时间对原生质体形成率和再生率的影响。以溶菌酶浓度为0.5 mg/mL，酶解温度为37 ℃，测定酶解时间对原生质体制备的影响。由表1可知，在10 min ～30 min范围内，原生质体形成率随着酶解时间的延长而增加，而原生质体再生率则呈现先上升后下降趋势。酶解时间为15 min时，原生质体形成率为98.23%，再生率达到31.51%。

(2)溶菌酶浓度对原生质体形成率和再生率的影响。由表1可知，随着酶解浓度的增加，原生质体的形成率不断提高，而再生率则呈现先上升后下降趋势。酶解浓度为0.5 mg/mL时，原生质体形成率为97.85%，再生率达到31.83%。

(3)酶解温度对原生质体形成率和再生率的影响。由表1可知，随着酶解温度的升高，原生质体的形成率不断提高，而再生率则呈现先上升后下降的趋势。酶解温度为37 ℃时，原生质体形成率为98.12%，再生率达到29.94%。

表1 原生质体制备的条件优化

2.3 紫外诱变致死率曲线

对枯草芽孢杆菌mutHS-301的原生质体进行不同时间紫外照射，并计算出原生质体致死率(图2)。可以看出，照射时间为20 s时，致死率为47.3%，随着照射时间的延长，致死率也跟着升高，当照射时间为100 s时，致死率接近100%。高致死率往往伴随着高突变率，能够起到筛选出高产菌株的目的。近年来有倾向于致死率在80%～90%的诱变剂量的诱变效果较好，其正突变率较高[19]。故本实验中紫外线照射时间选择为60 s，其致死率为88.6%。

2.4 高产抗菌脂肽突变菌株的筛选

经紫外诱变获得的突变菌株进行初筛和复筛，得到6株对指示菌抑菌圈有明显提高的菌株，分别命名为mutHS-501、mutHS-530、mutHS-539、mutHS-561、mutHS-580和mutHS-596。结果如图3所示。

图2 枯草芽孢杆菌mutHS-301致死率曲线

图3 诱变菌株筛选结果

由图3可以看出，6株突变菌株对指示菌抑菌直径较出发菌株mutHS-301有明显提高，其中mutHS-539对副溶血性弧菌和金黄色葡萄球菌抑菌直径较mutHS-301分别提高了21.49%和21.05%。

2.5 高产抗菌脂肽菌株遗传稳定性研究

将复筛得到的高产抗菌脂肽突变菌株进行遗传稳定性测定，经传9代后，并通过隔代发酵测定突变菌株产抗菌脂肽的量的变化。实验发现，突变株mutHS-539产抗菌脂肽的量最高，其产量较出发菌株mutHS-301提高了40%左右，而且它的产量波动较小，并在误差范围内无明显差异(图4)。由此可以看出，菌株mutHS-539是一株遗传性状十分稳定的突变菌株。

图4 诱变菌株mutHS-539的遗传稳定性

2.6 抗菌脂肽单组分的分离及对黄曲霉抑菌活性检测

通过TLC点板，发现获得的突变株mutHS-539发酵提取物主要含有4种组分(图5A)，分别为a、b、c和d，其RT值相应为0.83、0.74、0.56、0.28。利用制备型硅胶板对各个组分进行分离纯化，并对黄曲霉进行抑菌活性测定。发现获得的4种组分中只有组分d对黄曲霉有明显的抑制作用(图5B)。并经高效液相RP-HPLC检测，发现组分d中有3组主峰存在，通过已测定的液质联用数据对比，发现1、2和3号峰物质相对分子量分别为1 031.54、1 045.56和1 059.57，它们是抗菌脂肽Iturin家族杆菌霉素Bacillomycin D的C14、C15和C16同系物(图6)[15]。另外，根据峰面积归一化法可求得组分d中的杆菌霉素D含量达到95%以上。结果表明，枯草芽孢杆菌代谢产物抗菌脂肽中只有杆菌霉素D成分对黄曲霉有显著的抑制作用。

图5 抗菌脂肽单组分分离纯化及对黄曲霉抑菌作用

图6 组分d高效液相色谱图

2.7 抗菌脂肽提取物对黄曲霉菌菌丝生长的影响

抗菌脂肽提取物对黄曲霉菌菌丝生长的抑制作用如图7所示。采用十字交叉法测量含肽培养基上的菌落直径，结果如表2所示。研究发现随着抗菌脂肽浓度的提高，抑制作用越来越明显。当抗菌脂肽的浓度为0.14 mg/mL时，其对黄曲霉菌菌丝生长的抑制率超过了50%，而当抗菌脂肽的浓度达到0.20 mg/mL时，其对黄曲霉菌菌丝生长的抑制率达到了74.22%，这说明抗菌脂肽提取物对黄曲霉的菌丝生长具有较强的抑制作用。

抗菌脂肽浓度/(mg·mL-1)：A.0；B.0.08；C.0.10；D.0.12；E.0.14；F.0.16；G.0.18；H.0.20

表2 抗菌脂肽对黄曲霉菌菌丝的抑制率

2.8 抗菌脂肽提取物对黄曲霉孢子致死浓度的测定

以平板法测定抗菌脂肽提取物对黄曲霉孢子的致死浓度。结果如图8所示，培养至第8 d时，对照组(a)培养皿中有明显的霉菌生长且产生孢子，此时抗菌脂肽浓度为0.8 mg/mL的平板未发现有霉菌生长，即抗菌脂肽提取物对黄曲霉孢子的致死浓度为0.8 mg/mL。

抗菌脂肽浓度/(mg·mL-1)：a.0；b.0.05；c.0.1；d.0.2；e.0.4；f.0.6；g.0.8；h.1.0

3 结论

采用紫外诱变方法对枯草芽孢杆菌mutHS-301的原生质体进行诱变，通过筛选获得一株性状良好的突变菌株mutHS-539，其在抑制病原指示菌及抗菌脂肽产量上较出发菌株均有显著提高。进一步对其所产的抗菌脂肽提取物进行单组分分离纯化，获得的4种组分中只有组分d对黄曲霉有显著的抑制作用，经数据对比和分析，发现该组分为杆菌霉素D。本文的研究为今后将其开发为天然防腐剂奠定理论基础。