乳杆菌在发酵乳饮料中的应用

唐立伟, 李 想, 左晨旭, 陆文蔚, 韩 梅

上海商学院，上海 200235

乳酸杆菌是乳酸菌中最大的一个属，是一类能够发酵碳水化合物产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌，常用于益生菌粉的生产和酸奶发酵。乳酸杆菌的形态多样，有长杆状、短杆状、栅栏状[1]。目前已被发现的乳酸杆菌超过60个种，按照发酵类型可分为同型发酵群(嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、保加利亚乳杆菌等)、兼性异型发酵群(干酪乳杆菌)和专性异型发酵群(高加索酸奶乳杆菌)；按照菌种间系统发育关系可分为植物乳杆菌群、唾液乳杆菌群、嗜酸乳杆菌群等8个群体[2]。

人体的肠道内有上百类菌种，各菌种间相互作用，协调制约，维持肠道微生态系统的平衡。乳酸杆菌可以定植在机体肠道内，与宿主体内不正常的细菌竞争，提高肠道菌群中乳酸菌的优势，乳酸菌产生的抗菌素可以阻止部分病毒侵入宿主细胞，维持微生态系统的平衡，能够改善和治疗肠道疾病[3-5]。乳酸杆菌具有提高机体免疫的能力，调节机体特异性和非特异性免疫的作用[6-8]。乳酸杆菌的代谢产物还具有抗氧化能力，可以清除自由基O2-、DPPH、羟自由基等[9-11]。所以乳杆菌被广泛的应用于益生菌产品的开发。

1 材料与方法

1.1 菌种

副干酪乳酸杆菌(科汉森)；鼠李糖乳杆菌(科汉森)；瑞士乳酸杆菌(丹尼斯科)；嗜酸乳酸杆菌(科汉森)。

1.2 主要试剂

MRS培养基、氢氧化钠、牛奶等。

1.3 乳饮料的制备

鲜奶→分装→95 ℃灭菌2 h→冷却到37 ℃→接种→发酵→乳饮料基料

称取200 g纯牛奶于250 mL的玻璃瓶中，在 105 ℃温度条件下高压蒸汽灭菌15 min。牛奶灭菌后将其放入超净工作台内，待牛奶冷却，使用移液枪接入2%培养好的乳酸杆菌种子液，放入37 ℃的恒温培养箱中发酵。分别于24 h、48 h和72 h监测基料的各项指标。

水→白砂糖(9%)、果胶(0.3%)→搅拌配料(60 ℃～65 ℃)→杀菌(90 ℃～95 ℃，10 min)→冷却→基料(30%)混合搅拌(15 min ～20 min)→无菌均质[室温，一级压力(16.5±0.5)MPa，二级压力(3.5±0.5)MPa]→灌装→冷藏

1.4 分析方法

酸度的测定：取10 g发酵乳，加入20 mL的水，用0.1 mol/L的氢氧化钠滴定到酚酞呈红色所用氢氧化钠的量。

菌种计数：将牛奶梯度稀释后，浇注平板，在MRS上生长的为乳杆菌，取菌数在30～300的平板进行计数。

有机酸的测定：配制0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液，并用标准的磷酸溶液调整该溶液至pH为2.8，加入1%的甲醇，经水系膜过滤两次。色谱柱为Agilent SB-C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；流速1 mL/min，柱温25 ℃，检测波长210 nm，进样量20 μL，检测时长为10 min。

样品的处理：称取一定量的样品，6 000 r/min离心10 min，吸取上清液用水系膜过滤两次到小样品管中，待用。

乳酸菌耐胃酸实验：配制0.1 mol/L 柠檬酸，用0.2 mol/L Na2HPO4将柠檬酸溶液的pH调整到2.5和3.0，将乳酸菌发酵液离心后用十倍体积的缓冲液悬浮，37 ℃保温放置，测0 h和3 h时的活菌数。

2 结果与讨论

2.1 乳酸杆菌发酵牛乳过程中pH、滴定酸度变化

原料乳在发酵过程中，在一定时间范围内，发酵乳的pH会随着乳酸的积累而降低，如图1所示，不同种类的乳杆菌，其发酵能力不尽相同。从pH来看，瑞士乳杆菌的pH明显低于其他四类乳杆菌；鼠李糖乳杆菌在48 h后基本停止产酸，pH不再明显变化。总的来说五种杆菌发酵的乳品在48 h后，pH的变化幅度减小。72 h内五种乳酸杆菌的pH大小为瑞士乳杆菌<嗜酸乳杆菌<副干酪乳杆菌<鼠李糖乳杆菌。

鼠李糖乳杆菌

副干酪乳杆菌

嗜酸乳杆菌

瑞士乳杆菌

图1 四种乳杆菌的酸度和pH

从酸度来看，24 h内，五类乳酸杆菌的酸度都达到100 °T以上，由此可见，乳杆菌在发酵过程中具有较强的产酸特性。瑞士乳杆菌仍表现出显著超过其他杆菌的产酸能力，24 h酸度已超过200 °T，72 h可达到323 °T。据研究，绝大部分乳酸球菌的最大产酸量一般只能达到64 °T ～ 90 °T的范围[12]，而乳杆菌发酵乳酸度可达100 °T～200 °T，甚至超过300 °T，其产酸能力远远大于乳酸球菌。据资料显示，符合大众口感与品质需求的酸奶，pH一般在4.2～4.4范围内，滴定酸度在70 °T左右[13]。因此，乳酸杆菌不适用于制备传统的发酵乳，反而更适用于乳饮料，比如养乐多、褐色乳酸菌饮料产品。

利用Cinac乳品发酵监控仪监测发酵乳24 h内pH变化，由图2可以明显看出，四种乳杆菌pH都随着发酵时间的增加而降低。其中瑞士乳杆菌发酵乳pH的下降速率最快，副干酪乳杆菌发酵乳pH变化速率最低，因此瑞士乳杆菌的产酸能力最强。瑞士乳杆菌发酵乳pH曲线在20 h后下降趋势减缓，而鼠李糖乳杆菌和干酪乳酸杆菌仍在平稳下降。

图2 五种乳杆菌的发酵曲线

2.2 乳杆菌发酵不同原料乳过程中的活菌数

由表1的实验数据显示，四种乳杆菌在发酵4%蛋白含量的脱脂乳粉时，3 d内其活菌数相比发酵牛乳和3%蛋白含量脱脂乳粉更适宜于活菌数的积累，因为牛奶蛋白有较好的缓冲能力。但是如果蛋白质含量进一步升高，基料中固形物含量过高，而导致生产过程原料输送困难。鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌在发酵过程中菌数不断增加，但是瑞士乳杆菌，发酵一天后活菌数开始衰减，嗜酸乳杆菌从第二天也开始衰减。所以后续饮料的制备采用4%的蛋白含量制备发酵乳饮料基料。鼠李糖和副干酪乳杆菌采用72 h发酵，嗜酸乳杆菌发酵48 h，瑞士乳杆菌发酵24 h。

表1 五种乳杆菌发酵3 d内活菌数

2.3 发酵乳饮料的制备

市面上出售的活菌型乳酸菌饮料，保质期一般为21 d，在保质期内，发酵乳的活菌数越多，保质期内衰减量越低，乳品品质评价也越高。因此通过追踪21 d内五种乳酸杆菌的活菌数，筛选出品质最优的菌株来投入到原料乳发酵中。

从表2和表3可以看出，7 d 内五种乳杆菌的活菌数没有较大的变动，基本都在一个数量级上波动；7 d后发酵乳内的活菌数开始逐渐降低，7 d ～ 14 d内乳酸杆菌死亡速率较快。在整个货架期内，副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的活力保持较好，瑞士乳杆菌和嗜酸乳杆菌在7 d以后菌数下降较快，降低2～3个数量级，存活率不足1%。

表2 发酵乳基料21 d内活菌数变化

表3 乳饮料货架期内活菌数

2.4 乳饮料中有机酸的定性分析

发酵乳中决定风味的重要物质主要是一些挥发性和非挥发性有机酸。乳品中的有机酸具有抑制有害细菌繁殖的作用，还可以提高发酵乳的安全性。因此，乳品中保证适当的有机酸种类及含量，对于乳品生产中的质量监测十分重要。发酵乳中的天然有机酸种类主要有乙酸、丁酸、柠檬酸、乳酸、丙酮酸、甲酸、丙酸[14]。

目前有机酸定量定性的方法主要有高效液相色谱法、毛细管电泳法和气相质谱连用法等。HPLC法操作简单、灵敏度高、快速准确和应用广泛。本文通过高效液相色谱法对4种乳杆菌代谢产生的有机酸进行了分析，如图3所示。标准混合样品中含有草酸、甲酸、D-苹果酸、维生素C、乳酸、乙酸、柠檬酸和L-苹果酸，并且按照相应时间依次出峰。对应四种乳杆菌制备的发酵乳的液相色谱图可知，四种发酵乳的有机酸种类大致相同，都以乳酸为主，含有少量的乙酸，更少量的草酸、柠檬酸和L-苹果酸，它们都是发酵乳酸味的主要来源物质，赋予发酵乳独特的风味。所以用这四种乳杆菌制备的发酵乳，有机酸的种类差异较小。

图3 四种乳杆菌发酵乳色谱图

2.5 乳杆菌耐胃酸的性质

乳杆菌只有能耐受人体胃酸才能顺利到达大肠定植，发挥其益生菌的功效，所以乳酸菌对胃酸的耐受活力一直是优良乳酸菌的筛选标准。由表4可知，四种乳杆菌在pH 3.0时都有很高的存活率。但当pH降低到2.5时，存活率极具下降，尤其是瑞士乳杆菌和副干酪乳杆菌，鼠李唐乳杆菌的耐酸性最好，其次是副干酪乳杆菌。所以正常情况下人体胃液的pH在2.0左右，可以杀死大部分益生菌，益生菌产品不建议空腹食用。

表4 四种乳酸菌对胃酸的耐受性

3 结论

4株乳杆菌都可以代谢乳糖产生乳酸，并且有机酸组成类似。瑞士乳杆菌的产酸速率最快，但是货架期内活菌数衰减最快。副干酪乳杆菌发酵速度最慢，但是产品货架期内活菌数比较高，产品稳定性好。鼠李糖乳杆菌耐胃酸能力最好，并且货架期稳定性优良。本文为乳酸菌饮料的开发提供了参考依据，后续可以研究不同乳杆菌之间的复配，在提高产酸速率的同时，提高产品货架期内活菌数。