基于文献计量的微藻收获技术研究分析

李海健， 周化岚， Sarman Oktovianus Gultom, 张建国*

1.上海理工大学 医疗器械与食品学院 食品科学与工程研究所，上海 20093;2.Department of Agricultural and Biosystems Engineering, Papua University, Manokwari, Papua Barat, Indonesia

微藻具有能以光自养模式利用光和二氧化碳生长积累油脂，也能以异养模式利用其它碳源生长的优点而被广泛用于生物能源，生产高附加值物质，以及废水处理等多个领域[1]。微藻在生物能源方面的研究主要集中在以下几个方面：(1)获得富油藻种，例如富油藻种的筛选[2, 3]，以及基因工程改造微藻达到富油性能[4]；(2)微藻积累油脂的过程工程研究，例如培养基中营养元素的优化[5]、温度及光照强度等环境因素的优化；(3)建立简单、易行的油脂测定和提取方法，例如利用核磁共振的方法测定油脂含量[6]。近年来，利用微藻生产高附加值物质的研究也日益增多[7]。微藻积累的多不饱和脂肪酸可以作为食用营养品，还可以作为细胞工厂生产疫苗、单克隆抗体、抗生素、蛋白药物、激素、肠道活性蛋白和工业用酶等[8]。小球藻自身能合成的氨基酸、多肽、维生素和核酸等已经被制作为小球藻生长因子(chlorella growth factor),在增强免疫、抑制肿瘤、改善代谢综合征、清除自由基、抵御紫外损伤、螯合重金属以及保肝护肠等多个方面展现了良好功效[9, 10]。微藻用于废水处理也是一种非常有前景的绿色技术。微藻吸收营养能力强，可以高效利用废水中有机质、氮和磷等污染物合成生物质，并达到处理废水的目的。微藻在处理农业废水、工业废水、城市废水和含农药以及抗生素等有害废水方面都有报道。很多学者对藻类处理废水的原理、技术路线、藻种筛选、环境条件等方面都有研究，为生态建设提供了新思路[11]。

为了获得微藻中的油脂、高附加值物质，微藻收获是必不可少的步骤。但是由于微藻在培养体系中浓度较低(约0.3 g/L～5 g/L)和体型较小(Φ2 μm～40 μm)，导致微藻收获步骤的成本占总成本高达20%～30%，因此，微藻的大规模应用相对较少[12]。微藻收获成为其工业化的热点问题。本文从文献计量的角度阐明微藻收获的研究趋势，同时，也展示了我国在微藻收获的研究方面所处的位置，最后分析了研究动向，为微藻收获和相关研究提供参考。

1 文献数据来源

本文以web of science数据库为数据来源，以 microalgae harvest为主题词搜索相关文献，时间截止至2019年7月31日，检索结果共2 471篇文献，经手工剔除，得到关于微藻收获相关文献共742篇。

国内文献研究以万方中文数据库为数据来源，以“微藻收获”为关键词搜索，加上手动获取和筛选，共得到文献334篇。

2 文献检索结果与分析

2.1 微藻收获研究的趋势

Web of science数据库中最早收录的有关微藻收获的研究为2001年Oh报道的使用类芽孢菌属的生物絮凝剂收获小球藻。自2009年起，有关微藻收获的文献数量逐年增加，成为研究热点(图1)，尤其在2018年已达到139篇。截止2019年7月31日，2019年出版的文献数量为103篇。这说明微藻收获的研究逐渐增多，依然是研究热点。

图1 微藻收获的文献随时间的变化趋势

2.2 文献种类分析

从文献类型的组成来看(图2)，数量最多的文献为研究论文，占65.9%。然后依次是专利(19.7%)、评论(6.2%)、会议论文(5.3%)和摘要(1.8%)，其他文献占1.1%。图2表明专利为数量第二多的文献，说明研究人员认为微藻收获的研究具有很大应用潜力，需要进行专利保护。

图2 微藻收获文献的类型

2.3 文献量前10的国家及其文献引用

微藻收获的文献共来自56个国家和地区。发表文献总数前10的国家见图3。

图3 微藻收获文献数量的前10国家

前10国家的文献数为528篇，占文献总数的71.2%。排名前10的国家和地区依次为中国、美国、韩国、马来西亚、印度、西班牙、比利时、英国、澳大利亚和加拿大。其中，我国发表文献 184 篇，占总文献量的24.8 %。图4为前10国家的文献平均引用次数。比利时的每篇文献平均引用次数最多，为42.6次/篇，其次为英国(27.7次/篇)、美国(27.2次/篇)、澳大利亚(23.4次/篇)。我国每篇文献的平均引用次数为19.4次/篇。这说明我国有关微藻收获的文献虽多，但其影响力还有待进一步提高。

图4 文献总数前10国家的每篇文献引用次数

2.4 文献数量前5国家在近10年内的文献数量变化

对文献总数前5名国家的文献数量进行分析，可以看出我国文献的增长趋势较为明显(图5)。我国的文献数从 2010一直增长到 2016年，2017年文献数稍有降低后，2018年又呈上升趋势，达42篇，是美国发表文献最多年份文献数量(2018年13篇)的 3.2倍。来自美国的文献数量出现小幅度波动，总体维持在10篇/年左右。印度的文献数量在2010年—2015年之间较为平稳，2016年后，呈持续上升趋势。2014年以来，我国的文献数量始终高于其他国家的文献量，而且优势明显，说明我国已经成为研究微藻收获的活跃地区。

图5 发表文献数量前 5 的国家的文献数随时间的变化

2.5 研究方向

对web of science数据库收录的微藻收获文献研究方向进行分析，可以发现在生物技术和应用微生物(Biotechnology and Applied Microbiology)方向的研究最多，占62.4%。这说明从微生物方向入手对微藻收获进行研究最多，其次依次为能源燃料(30.5%)、化学(27.5%)和农业(23.9%)等。

2.6 基于万方数据库的国内文献数量变化

在万方知识数据服务平台中以微藻收获为关键词搜索，共得文献334篇，文献数量逐年增加(图7)，其中2014年—2016年达到了研究的顶峰期，期间内每年约48篇，2017年至今国内发表文献数逐年减少，而且中文期刊论文比专利和学位论文数量少，而国际上我国对微藻收获技术的研究呈逐年上升趋势(图5)。其中部分原因可能为我国学者注重将研究结果优先发表在web of knowledge索引的国际期刊上。中文文献中52%为专利(图8)。这说明我国学者对微藻收获技术优先进行专利保护。其次是学位论文、期刊论文、会议论文、科技报告、成果。

图6 微藻收获文献的主要研究方及其占比

图7 近10年国内发表文献数随时间的变化

图8 国内发表文献类型占比

3 展望

文献计量分析表明微藻收获正在处于研究热点，也说明微藻收获对社会可持续发展具有重要意义。下面对有关微藻收获相关研究进行展望，以企为将来的相关研究提供参考。

3.1 微藻对可持续发展的重要作用

我国在过去20年里经历了高速发展时期，2010年成为世界第1大能源消费国。我国能源消费在全球的比重由1990年的4%，上升到2006年的10%，2019年将达到18%[13]。当前，我国大部分能源来自煤炭(66.2%)、石油(18.8%)、天然气(5.4%)等非再生原料，共占总能源约90%[14]。自1990年我国变成原油净进口国以来，2015年我国石油进口量达到54 300万吨，占全国石油消费量的60.6%[15]。所以开发可持续能源是我国进一步发展的必由之路。我国规划在2020年生产230万吨生物柴油。但是，我国2015生产约114万吨生物柴油[16]，所以，继续提高生物柴油产量的需求很紧迫。石油能源对环境的影响也十分巨大。2015年全球石油能源的二氧化碳排放量占全部二氧化碳排放量的34%。根据国际能源机构(International Energy Agency)的报告，我国2015年的二氧化碳排放量占全球二氧化碳总排放量的28%，约9×109吨。微藻的自养模式不仅可以提供可持续能源，还可以降低二氧化碳排放量。采用生物能源，每生成1 kg微藻能吸收2 kg二氧化碳[17]。预计在2050年我国能减少3.7×108吨二氧化碳[15]。XIN等在2016年计算微藻生物柴油的成本约为2.23美元/加仑[18]，2018年时重新评估后价格变为1.85美元/加仑[19]。开发进一步降低成本的新微藻收获技术对我国经济建设，以及世界可持续发展具有重要意义。

3.2 微藻收获技术的发展

目前微藻收获方法包括离心、过滤、浮选、沉降和化学絮凝等。离心法虽然可以快速收集微藻细胞，但需要投入设备和大量的能量[20]。过滤法易出现膜堵塞，需要不断清洗[21]。自然沉降法的速度缓慢。浮选法耗能较大[22]。化学絮凝法的絮凝剂和微藻细胞粘附成的无定型细胞团仍然需要过滤、离心、或者沉降等步骤进一步分离。而且大量使用氯化铁、硫酸铁、硫酸铝、聚丙烯酰胺等化学絮凝剂会对环境产生污染[23]。美国能源部报道的脱水和干燥相结合的微藻收获方式需要动力传输和电加热，成本较高[24]。ZHANG和SARMAN 报道的利用丝状真菌和微藻共培养形成菌丝球的方式可以收获100%微藻，而且不需要添加任何化学物质，不需要大型设备[25, 26]。丝状真菌和微藻共培养迅速成为研究热点[27]。而且，丝状真菌和微藻共同培养形成菌丝球降低培养液的粘度，提高培养液的透明度，有利于光线的射入，对微藻生物量和代谢物产量有协同作用。许多丝状真菌，例如黑曲霉、烟曲霉、红绶曲霉、Aspergilluslentulus、Isariafumosorosea都可以与微藻(普通小球藻、布朗葡萄藻、Auxenochlorellaprotothecoides、Nannochloropsissp.)共培养形成菌丝球[23]。这种共成球技术不仅可以达到收获微藻的目的，而且可以应用到废水处理、高附加值代谢物生产等方面，例如去除废水COD、总氮和总磷，吸附重金属[28]，降解有害化合物[29]，及积累脂肪酸(C16-C18>83%)等[30]。丝状真菌和微藻的共同培养形成菌丝球是一个含有固体、液体和气体的异质化培养体系。其影响因素包含菌种类型、种子形式、种子浓度、生长速率、培养基成分、颗粒、反应器类型及培养策略等。丝状真菌和微藻在不同应用场景下形成菌丝球所需要的条件也不一样。XIA前期利用调控pH的方式将卷枝毛霉形成菌丝球[31]。菌丝形态对丝状真菌的代谢有很大影响[32]。例如聚半乳糖醛酸酶[33]、木质素过氧化酶、葡萄糖糖化酶和呋喃果糖苷酶[34]等在菌丝球形态下产量较高。这些酶将微藻细胞壁水解产生的碳水化合物，用作丝状真菌生长的碳源，生长为菌丝球，达到收获微藻的效果。所以，丝状真菌和微藻共同形成菌丝球技术是值得大力推广的微藻收获思路。

3.3 共成球方法收获微藻的基础研究

共成球方法收获微藻主要综合静电相互作用、疏水相互作用和细胞壁组分的盐桥作用三种作用力[25-26, 35]。由于丝状真菌和微藻细胞均呈负电荷，具有静电相互作用。丝状真菌壁的羧基是负电荷的主要来源。孢子壁中黑色素富含羧基。分别敲除黑曲霉和烟曲霉合成黑色素的一个基因后，黑曲霉[36]和烟曲霉[37]孢子负电荷均明显减少。而且，黑曲霉和白地霉孢子壁被聚丙烯酸羧化后表现出同样的电荷量[38]。利用乙酸十二烷胍的氨基与菌孢子壁的羧基发生反应，可使孢子的负电荷变为零，甚至变为正电荷。不同种类细胞所带的电荷不同，而且受到pH、离子强度、离子化合价和阳离子浓度等因素影响。高pH时孢子呈现负电荷多，细胞之间的静电相互作用抑制聚集。例如，高pH时孢子不能与带有负电荷的云母片粘附[39]。减少孢子负电荷量，降低了静电相互作用，有利于孢子聚集。例如，孢子在等电点条件下利于孢子聚集。而且溶液中反离子(counter-ion)中和负电荷，也有利于孢子聚集[40]。丝状真菌和微藻的静电相互作用可以借助胶体化学的DLVO(Derjaguin, Landau, Verwey, Overbeek)理论表征[41]。

疏水相互作用是细胞之间相互粘附的一个重要因素[42]。细胞的疏水相互作用来自一种含有100～150个氨基酸，具有两亲性的疏水蛋白。孢子和气生菌丝上都含有疏水蛋白。疏水蛋白在孢子表面形成厚度为5 nm～10 nm的涂层。气生菌丝由于表面疏水蛋白涂层而可以延伸到空气中[43]。细胞之间疏水相互作用较大时，吉布斯自由能低，有利于细胞聚集。敲除疏水蛋白基因导致孢子疏水性降低[44]。孢子的疏水相互作用也受到pH和离子强度的影响。pH由2.5升到5.0，导致疏水相互作用下降36.4%[45]。离子强度由0.5 mol/L NaCl降到0.05 mol/L NaCl，导致疏水相互作用下降25%。

盐桥作用主要来自细胞壁的几丁质、葡聚糖、疏水蛋白、黑色素和脂肪类组分[46]。细胞壁成分的不同导致盐桥作用的差异。丝状真菌孢子壁和菌丝壁的碳水化合物含量分别为2.5%和64.5%，而孢子壁和菌丝壁的蛋白质含量分别为63.4%和6.6%。胞外多糖在菌丝体和微藻细胞的聚集中起重要作用[47]。丝状真菌孢子萌发时，疏水蛋白和黑色素褪去，露出多糖结构[48]，细胞可以附着在α-1,3葡聚糖链上[49]。因此，α-1,3葡聚糖对细胞和菌丝体的聚集有重要影响[50]。

上述三种作用力都受到细胞壁组分的影响。目前培养条件、细胞的生理状态、细胞壁组分、细胞之间的作用力之间的关系还没有统一起来。所以，对丝状真菌和微藻共同培养收获微藻的机制还需要进一步明确，指导收获微藻的研究。