一株产甲萘醌-7(MK-7)菌的分离鉴定及产物合成条件的初步研究

徐建中，　王颖妤，　严为留，　张伟国

江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122



一株产甲萘醌-7(MK-7)菌的分离鉴定及产物合成条件的初步研究

徐建中，王颖妤，严为留，张伟国*

江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏无锡 214122

摘要：本文从豆豉中分离出了一株高产MK-7的菌株并对其进行了鉴定，同时对该菌合成MK-7的条件进行了初步研究。在参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，并根据形态学特征、生理生化特性、并结合16S rDNA序列分析结果，该菌属于解淀粉芽孢杆菌。该菌合成MK-7的最佳条件为：发酵温度37 ℃、装液量为30 mL/250 mL、接种量为2%和摇瓶培养时间为3 h。研究发现，菌株Y-2合成的MK-7主要存在于细胞内。以上结果可为基于菌株Y-2选育高产MK-7菌株和实现MK-7的产业化提供理论依据。

关键词：中国豆豉； 甲萘醌-7； 解淀粉芽孢杆菌； 产物分布

豆豉(Douchi; Lobster sauce)是我国传统的大豆发酵制品，因其营养丰富、药食兼用，而在我国四川、江苏、山东等地区广泛食用。根据参与发酵的优势微生物菌群不同，可将豆豉分为霉菌型豆豉和细菌型豆豉[1]。细菌型豆豉多是利用枯草芽孢杆菌、豆豉芽孢杆菌、乳酸菌等微生物在较高温度下作用于蒸熟的大豆，借助微生物蛋白水解酶作用而制成的。豆豉营养价值高，除含有大量人体必须的氨基酸外，还含有多种维生素如维生素K1和维生素K2[2]。

维生素K2，又称为甲萘醌，是由一个甲基萘醌母环和一条位于母环C-3位置上的异戊二烯侧链组成的一类具有醌类结构的脂溶性化合物[3]。根据侧链上异戊二烯单元个数不同，甲萘醌共分为14种，以MK-n表示。甲萘醌-7(MK-7)为MK-n中的一员，其侧链上含有7个异戊二烯单元。MK-7具有较长的半衰期，在血液中很稳定，因而是哺乳动物产生凝血因子II、VII、IX和X的一个非常重要的辅因子，对血液凝固是不可或缺的营养素[4, 5]。Kim等[6]指出，MK-7还具有降血压的作用。此外，MK-7可以抑制成骨细胞的生长，从而刺激成骨细胞的分化，形成骨头。有国外学者指出，每天补充一定量的MK-7能够显著提高老年人骨头中的矿物质密度(BMD)，降低老年人的髋骨骨折风险[7]，而在健康的青春期前期儿童体内补充少量的MK-7可以提高体内游离的MK-7含量，有利于提高骨钙蛋白的羧化作用[8]。此外，MK-7能够协助调控Ca2+的利用和促进Gla蛋白质(Matrix Gla Protein，MGP)的活性，从而防止钙质在血管中沉淀而造成的动脉硬化[9]。因此，MK-7是国际上新兴的第三代预防和治疗骨质疏松的保健食品，其安全性已得到美国FDA、中国SFDA、美国药品研究所及欧洲议会和欧盟理事会的权威认定，其功能正在受到越来越多的关注。

传统的MK-7生产方法是直接从发酵煮熟大豆形成的豆豉或纳豆中提取，其菌种主要为能够产生纤溶酶的芽孢杆菌属。随着研究的深入，研究人员发现纤溶酶产生菌在发酵过程中除了合成纤溶酶外，还能合成大量的MK-7等维生素K2[10]。因此，纤溶酶产生菌具有极大的合成MK-7的潜力。Wu等[11]从韩国传统发酵食品Cheonggukjang中分离到了一株MK-7高产菌BacillusamyloliquefaciensBY01，对其发酵条件优化后，BY01的MK-7产量达到了7.54 μg/g，比原产品含量提高了2倍。Berenjian等[12]从商品纳豆中也筛选到了一株MK-7高产菌，利用中心复合设计对其合成MK-7的发酵条件进行优化后MK-7产量达到了62.32 mg/L，是目前有报道的最高产量。然而，需要指出的是目前利用纤溶酶产生菌发酵生产MK-7的培养基成本还比较高，且MK-7产量还不高，因此对MK-7高产菌的选育工作还有待于进一步深入。本研究以我国不同区域的豆豉为研究材料，分离鉴定出一株具有淀粉水解能力的、高产MK-7的菌株——解淀粉芽孢杆菌Y-2(B.amyloliquefaciensY-2)，并分析了该菌大量合成MK-7的最佳条件以及发酵过程中MK-7的分布。研究结果可为基于菌株Y-2选育高产MK-7菌株和实现MK-7的产业化提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

样品：来自我国不同省份和不同生产厂家的10份豆豉样品的厂家有：T厂家(产地：江苏)、H厂家(产地：江苏)、S厂家(产地：四川)、R厂家(产地：重庆)、L厂家(产地：广东)Q厂家(产地：广东)D厂家(产地：江西)、J厂家(产地：福建)、Y厂家和W厂家(产地：山东)。

试剂：MK-7标准品(纯度99.8%)购于美国ChromaDex公司；酵母提取物和蛋白胨购于英国Oxiod公司；甲醇、乙腈和二氯甲烷为色谱纯，购于国药集团上海化学试剂厂；基因组提取试剂盒和Taq DNA聚合酶购于宝生物(大连)生物技术有限公司；引物合成、DNA 产物纯化试剂盒购于生工生物(上海)有限公司。

1.2菌株的分离与培养

1.2.1培养基及培养方法

分离基本培养基(g/L)：15 葡萄糖、15 大豆蛋白胨、5 纤维蛋白、1 KH2PO4·12H2O、2.5 K2HPO4·3H2O、2.5 MgSO4·7H2O、0.5游霉素和15琼脂，pH 7.0～7.2。种子培养基(g/L)：15 葡萄糖、15 蛋白胨、1 KH2PO4、2.5 K2HPO4·3H2O、2.5 MgSO4·7H2O，pH 7.0～7.2。发酵培养基(g/L)：1 L 玉米粉液化液、41.52 豆粕粉，16.31 大豆蛋白胨、15.51 酵母膏、0.13 K2HPO4·3H2O、3.11 NaCl，pH 7.0～7.2。分离培养基和种子培养基在0.1MPa下高压灭菌20 min，而发酵培养基在0.07 MPa下高压灭菌20 min。菌体培养温度为(37±1) ℃，培养时间为8～12 h。非特殊说明，在摇瓶发酵培养时将对数生长期的种子液按2%(v/v)接种量转接于发酵培养基中，并以100 r/min在往复式摇床上培养24 h。

1.2.2操作方法

取0.5 g样品于含有少量玻璃珠的10 mL无菌生理盐水中，80 ℃水浴震荡10 min。取100 μL悬浮液，用适量无菌生理盐水稀释，取200 μL稀释液涂布于初筛平板上，37 ℃培养12 h，从中挑选出能产生透明溶解圈的菌落并通过平板分离和划线获得单菌落。挑选产生透明溶解圈大的菌落转接到MK-7发酵培养基中，37 ℃培养24 h，8 000 r/min离心去菌体，采用薄层层析法(TLC)测定各菌落合成MK-7的能力，最终筛选出高产MK-7的菌株。

1.3菌株鉴定

对分离到的高产MK-7菌株参考《常见细菌鉴定手册》[13]和《伯杰氏细菌鉴定手册》[14]进行形态学和生理生化鉴定。16S rDNA鉴定时采用细菌基因组提取试剂盒提取菌株Y-2的全基因组并为PCR反应模板，以细菌16S rDNA通用引物(F: 5’-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；R: 5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’)为引物，利用ExTaq DNA聚合酶进行PCR扩增反应。PCR 反应条件为: 95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，72 ℃ 终延伸10 min，整个程序循环30次。PCR产物纯化后送交生工生物工程(上海)有限公司进行测序，测序结果通过在线分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性分析并采用软件MEGA 5.0构建系统发育树。

1.4纤溶酶活的测定方法

纤溶酶活的测定采用标准纤维蛋白平板法[15]。每次点样20 μL，37 ℃培养12 h后测定透明圈的直径，再和尿激酶标准曲线比较，得出与尿激酶酶活单位(IU/mL)相对应的豆豉纤溶酶的酶活。纤溶酶活标准曲线的制作：将稀释的尿激酶标准品(20 IU/mL、40 IU/mL、60 IU/mL、80 IU/mL、100 IU/mL和120 IU/mL)各20 μL，点样于标准纤维蛋白平板，37 ℃保温12 h，测定透明圈的面积，以溶圈直径乘积对数为横坐标，浓度对数为纵坐标，绘制尿激酶标准曲线。

1.5MK-7的提取与检测方法

1.5.1样品中MK-7的提取方法

MK-7的提取参照Berenjian等[12]和严为留等[16]建立的方法进行，萃取剂选用2︰1(v/v)的正己烷/异丙醇。发酵结束后，发酵液经常温下5 000 r/min条件下离心5 min，收集上清液和菌体。在萃取上清液时，按上清液/萃取液为41(v/v)加入萃取液，漩涡振荡10 min，然后5 000 r/min离心5 min后回收有机相。在对菌体萃取时，按菌体量/萃取液为4︰1(w/v)加入萃取液，其他步骤与萃取上清液时相同。随后，将获得的有机相溶液于40 ℃减压旋转浓缩，完成MK-7的提取。在整个提取过程中尽量避光，同时增加萃取次数以提高提取效率。

1.5.2样品中MK-7的检测

利用TLC方法检测MK-7时，参照Morishita等[17]建立的方法进行，其中硅胶板选用60GF254型号，展开剂为己烷-乙醚(85︰15；v/v)。层析结束后，利用UV分光光度计在254 nm下检测MK-7含量。利用高效液相色谱法(HLPC)检测MK-7参照严为留等[16]建立的方法，MK-7浓缩液溶解后采用0.22 μm微孔滤膜过滤，然后进行HLPC分析。液相色谱条件及进样量参照严为留等[16]设定的参数。

2结果与讨论

2.1高产MK-7菌株的筛选

根据纤维蛋白-琼脂平板上所形成的透明圈的大小，挑取6株形成大透明圈的菌株，分别命名为T-26、S-33、R-5、Q-11、Y-2和W-21。经标准纤维蛋白平板测定，它们的纤溶酶活在1 400～1 500 IU/mL之间(表1)。由于纳豆和豆豉来源的纤溶酶产生菌在发酵过程中主要合成MK-7，因此本文对6株纤溶酶高产菌在发酵过程中产MK-7的能力进行了考察。从表1中可以看出，菌株Y-2的MK-7产量最高，而菌株W-21几乎检测不出MK-7。因此，本文选择菌株Y-2作为后期高产MK-7菌株的研究。

表1　各菌株的纤溶酶活和MK-7产量

2.2菌株的鉴定

2.2.1菌株的形态学鉴定

高产MK-7的菌株Y-2在LBG平板形成的单菌落为深白色，不规则圆形，中央突起(图1A)。在培养前期，菌落呈半透明状，菌体粘稠度低；培养12 h后，菌落颜色逐渐发白，粘稠度增加；培养48 h，菌落直径可达到1 cm以上，菌落表面褶皱、变硬，中央不规则突起，边缘不光滑；继续培养，菌落的饱满度会下降，菌体贴在平板表面，不再生长。芽孢染色结果如图1B所示，视野中的菌体个体微小，长约3～5 μm，宽0.6～0.9 μm，其中有芽孢的短杆菌占多数，芽孢中生或次中生，呈球形或椭圆形，不明显膨大，多为两端均匀染色。

2.2.2菌株的生理生化鉴定

将菌株Y-2进行摇瓶培养时，菌液呈现独特的臭鸡蛋味；摇瓶静止培养时，菌体均富集在液体表面生长，表明其均为好氧菌。进一步的生理生化鉴定结果见表2，从表中可以看出，菌株Y-2能够利用葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖和甘露糖，但是不能利用乳糖和半乳糖；同时菌株Y-2在生长过程中也表现出了较强的水解淀粉、明胶和酪蛋白的能力。

2.2.316S rDNA鉴定及系统发育树分析

通过PCR扩增获得菌株Y-2的16S rDNA序列，所测得到的序列长度为1 516 bp。将所测序列提交到NCBI数据库进行比对分析，结果表明菌株Y-2与解淀粉芽孢杆菌有着最高的序列相似度(99%；图2)，与芽孢杆菌属其他种的芽孢杆菌也有较高的相似度，结合菌落形态，因此初步判断菌株Y-2属于解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)。

图1　Y-2的菌落形态(A)和芽孢染色效果图(B)

实验项目实验结果菌株Y-2菌株168实验项目实验结果菌株Y-2菌株168革兰氏染色++V.P.反应++M.R.试验++7%NaCl生长++葡萄糖++甘露糖+-阿拉伯糖+-乳糖、半乳糖-+淀粉水解++酪素水解++硝酸盐还原++明胶水解+-石蕊牛奶还原试验++厌氧生长试验--硫化氢产生试验--产生吲哚试验--接触酶++氧化酶++

注：“+”为阳性反应，“-”为阴性反应

2.3产MK-7条件的研究

2.3.1最佳培养温度和装液量

不同的培养温度和溶氧量对菌体生长和目的产物的合成都具有重要影响作用，因此本文考察了不同温度和装液量对B.amyloliquefaciensY-2产MK-7的影响，其结果见图3。

从图3A中可以看出，37 ℃是合成MK-7的最适温度，而这个温度同时也是菌体生长和合成纳豆激酶的最适宜温度。前期研究结果发现[3]，菌株Y-2在静置培养条件下能够合成更多的MK-7，而随着转速的提高，MK-7的产量大幅下降。然而，菌株Y-2又是好氧菌，因此菌体在培养的过程中都是富集在液体表面生长，摇瓶中过高的装液量反而导致菌体无法充分利用培养基组分而造成MK-7产量降低。因此，本文考察了装液量对MK-7合成的影响，从图3B中可以看出，30 mL/250 mL三角瓶则是一个比较适宜的摇瓶装液量水平，而随着装液量的增加MK-7产量急速下降。因此，今后若是要工业放大，则可能需要参考浅盘发酵的培养工艺。

图2　菌株Y-2基于16S rDNA构建的系统发育树

图3　温度(A)和装液量(B)对MK-7产量的影响

2.3.2接种量和摇培时间的优化

将菌株Y-2的种子液分别按1%、2%、3%、4%和5%(v/v)的比例接种，考察不同接种量对MK-7产量的影响。从图4A中可以看出，在2%的接种量下，MK-7的产量最高，而随着接种量增大，MK-7产量反而降低，因此确定最佳的接种量为2%。此外，考虑到接种后直接静置培养不利于获得较高的菌体量，也不利于MK-7的合成，因此对接种后的摇瓶培养时间(即摇培时间)进行优化也非常有必要。本文考察了接种后分别摇瓶培养0 h、1 h、2 h、3 h和4 h对MK-7产量的影响，其结果如图4B所示。从图4B中可以看出，摇培3 h最有利于MK-7的合成，这可能是由于此时的菌体正处于对数生长期，菌体活力最为旺盛，因此确定接种后的摇培时间为3 h。

2.3.3MK-7的分布

Yanagisawa和Sumi[18]等研究发现，发酵液中存在大量的水溶性MK-7，并指出这是由于一部分MK-7与胞内某些蛋白质形成了复合物，并在培养过程中被释放到培养基内变成“水溶性”MK-7。为了弄清楚MK-7的分布情况，本文分别测定了发酵过程中菌体和发酵液这两部分中的MK-7含量，其结果见图5。

图4　接种量(A)和摇培时间(B)对MK-7产量的影响

图5　MK-7的分布情况

然而，与Yanagisawa和Sumi[18]的研究结果不同，本研究发现发酵液中确实存在部分MK-7，但含量只是菌体中的1/4～1/3(图5)。需要指出的是，随着发酵时间的延长，胞外MK-7含量逐渐增加，这一结果与Wu等[11]的研究结果基本一致。特别是到了第6 d，发酵液中MK-7的量出现了较大幅度的增长，几乎是第5 d的两倍，这可能是因为到了第6 d，菌体进入衰亡期，部分菌体开始裂解，导致胞内的那部分MK-7被释放到了胞外。考虑到液液萃取的效率和提取成本，在今后的工业化生产中可以进一步缩短发酵周期，在菌体生长到稳定期即可终止发酵，并且在提取操作时只针对菌体中的那部分进行提取，这样可以大大减少萃取液中杂质的含量，降低纯化成本，提高生产效率。

3结论

本文从中国豆豉中分离出了一株具有高纤溶酶活和MK-7的菌株，经菌体形态、生理生化特征和16S rDNA分析，鉴定为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciensY-2)。随后对该菌株合成MK-7进行了初步研究发现，该菌合成MK-7的最佳条件为：发酵温度为37 ℃、装液量为30 mL/250 mL、接种量为2%和摇培时间为3 h。此外，研究结果还指出，B.amyloliquefaciensY-2合成的MK-7主要存在于细胞内。以上结果可为基于菌株Y-2选育高产MK-7菌株和实现MK-7的产业化提供理论依据。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.001

基金项目：江苏省自然科学基金-青年基金项目(编号：BK20150149)。

作者简介：徐建中(1984～)，男，博士，讲师。E-mail：xujz126@126.com。

*通讯作者:张伟国(1963～)，男，博士，教授。

Identification and analysis of a menaquinone-7 (MK-7) producing strain

XU Jian-zhong， WANG Ying-yu， YAN Wei-liu， ZHANG Wei-guo

The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi, Jiangsu 214122, China

AbstractA high MK-7 producing strain was isolated from Chinese douchi. Moreover, the MK-7 synthesis conditions were investigated. The strain was classified into Bacillus amyloliquefaciens according to its morphology, physiological and biochemical features and 16S rDNA sequence. The results showed that the best MK-7 synthesis conditions of this strain were as follows: fermentation temperature 37 ℃, loading volume 30 mL/250 mL, inoculum size 2% and shaking culture time 3 h. In addition, MK-7 was mainly distributed in intracellular. The above-mentioned results provided a theoretical basis for constructing high MK-7 producing strains based on strain Y-2 and promoting MK-7 industrialization progress.

Key wordsChinese douche; menaquinone-7; Bacillus amyloliquefaciens; product distribution