乙醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

刘丽勤，　张骏梁，　谭　俊，　陈代杰，　李亚军，　邵　雷*

1. 上海师范大学生命与环境科学学院， 上海 200234； 2. 中国医药工业研究总院上海医药工业研究院创新药物与制药工艺国家重点实验室， 上海 201203



乙醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

刘丽勤1,2，张骏梁2，谭俊2，陈代杰2，李亚军2，邵雷2*

1. 上海师范大学生命与环境科学学院， 上海 200234； 2. 中国医药工业研究总院上海医药工业研究院创新药物与制药工艺国家重点实验室， 上海 201203

摘要：(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇是抗癌药物克唑替尼的手性合成前体，可由2,6-二氯-3-氟苯乙酮经乙醇脱氢酶催化还原制备，还原中所需的还原型辅酶Ⅱ再生是该反应的技术瓶颈。本研究构建重组大肠杆菌E.coli BL21-ADH和E.coli BL21-GDH，实现了葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的共表达，并进行偶联转化。结果表明，当在反应温度为30 ℃，pH为7的条件下，(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的产量达到最高，在投料量为6%时，该体系转化率为93.75%。

关键词：辅酶再生； 乙醇脱氢酶； 葡萄糖脱氢酶； (S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

由氧化还原酶催化的酮基的手性还原是获得含有羟基的手性化合物的重要方法[1]。其中苯乙酮相关化合物的手性还原产物是多种药物的手性中间体。克唑替尼由辉瑞公司开发用于治疗间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性的局部晚期和转移的非小细胞肺癌(NSCLC)，于2011年获得FDA批准上市[2-3]。克唑替尼的合成工艺中[4]，合成前体为(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，该前体可由2,6-二氯-3-氟苯乙酮经乙醇脱氢酶(ADH)[5]手性催化还原制备。氧化还原酶广泛用于催化制备手性醇、羟基酸、氨基酸等[6]，乙醇脱氢酶的催化反应需要还原型辅酶Ⅱ的参与[7]。还原型辅酶的价格昂贵，且很不稳定[8]，不可能作为大量制备(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的原料。在本文的工作中，我们使用葡萄糖脱氢酶(GDH)催化还原型辅酶Ⅱ的再生[9-10]，构建了双酶偶联体系，如图1所示，可以低成本的催化2,6-二氯-3-氟苯乙酮还原为(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇。

图1　(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的酶法合成

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种与质粒

E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、pET28a、pET21a均为本实验室保藏。

1.1.2培养基

LB培养基：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%氯化钠。在此基础上添加1.5%琼脂粉为固体培养基。

1.1.3仪器与试剂

电泳仪(北京市六一仪器厂)；凝胶成像仪(上海复日科技)；高效液相色谱仪(Agilent 1260)。限制性内切酶购自Thermo Fisher Scientific公司；质粒小量提取试剂盒购自上海生工生物工程有限公司；DNA Marker、蛋白质Marker、氨苄霉素(Amp)和卡那霉素(Kan)均购自北京鼎国生物技术有限公司；蛋白胨和酵母提取物(英国Oxoid公司)；2,6-二氯-3-氟苯乙酮购自上海邦成化工有限公司；(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇购自韶远科技(上海)有限公司；其他试剂均购自国药试剂有限公司。

1.2方法

1.2.1GDH重组表达菌株的构建表达与测活

根据GDH基因序列(Genbank Number：J04805.1)委托英潍捷基生物公司合成基因序列片段。将GDH基因用核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ从T载体上酶切回收，连入使用核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的pET28a载体，构建得到重组表达GDH的质粒pGDH-pET28a。

将pGDH-pET28a导入E.coliBL21(DE3)，得到GDH表达菌株E.coliBL21-GDH。挑取单菌落过夜培养后，以1∶100的比例接入含有100 μg/mL的卡那霉素的LB培养基中，37 ℃培养至OD600为0.6～0.8，加入终溶度为0.05 mmol/L IPTG。22 ℃诱导表达16 h。3 700 r/min，4 ℃离心收集菌体。将收集到的细胞重悬于缓冲液超声破碎获取目的蛋白，进行SDS-PAGE分析。

参考文献方法[11]，以葡萄糖为底物测GDH的酶活，总反应体积为1 mL，反应液组成为：100 mmol/L的磷酸盐缓冲液(pH=8.0)中加入2.0 mmol/L NADP+和100 mmol/L葡萄糖。反应混合物于30 ℃保温，加入一定量的GDH粗酶液后开始计时，每隔1 min检测NADPH在340 nm吸光度的增加量。

1.2.2ADH与GDH共表达菌株的构建

根据ADH基因序列(Genbank Number：AY267012)委托英潍捷基生物公司合成基因序列片段。将ADH基因用核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ从T载体上酶切回收，连入使用核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的pET21a载体，构建得到重组表达ADH的质粒pADH-pET21a。

将pADH-pET21a和pGDH-pET28a共转入E.coliBL21(DE3)，得到ADH与GDH共表达菌株E.coliBL21-ADH/GDH。将表达菌株E.coliBL21-ADH/GDH 接入LB培养基(含Amp和Kan各 100 μg/mL)中37 ℃培养。当OD600值达到0.6～0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2 mmol/L，22 ℃诱导16 h，SDS-PAGE电泳检测可溶性蛋白的表达。

1.2.3双酶偶联催化体系的构建与优化

将诱导表达的菌液在4 ℃，转速为3 800 r/min 离心15 min，弃去上清液，收集菌体，用适量的0.1 mol/L 三乙醇胺缓冲液(pH=7.0)洗涤。最后用0.1 mol/L三乙醇胺缓冲液(pH=7.0)40 ml 重悬后超声破碎。细胞破碎液在4 ℃，转速为3 700 r/min条件下离心15 min，收集上清液即为粗酶液。

在重组菌E.coliBL21-ADH/GDH粗酶液中(40 mL)，加入2.8 g葡萄糖，2.4 g 2,6-二氯-3-氟苯乙酮，置磁力搅拌器上，自动电位滴定仪调节pH稳定为7.0，30 ℃条件下反应一定时间，反应液加等体积乙酸乙酯萃取，离心取上清，分析底物及产物含量。摩尔产率=m产/m底× 100%；其中m底和m产分别代表底物2,6-二氯-3-氟苯乙酮的初始浓度和反应后(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的浓度(mol)。采用外标法测定产物生成量，分别配制0.625 mg/mL、1.25 mg/mL、2.5 mg/mL、5 mg/mL和10 mg/mL 的标准溶液，254nm检测紫外吸收。以溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，回归方程：y=457.56x+71.542(R2=0.999 9)。

1.2.4转化产物的分析

转化液加乙酸乙酯萃取，12 000 r/min离心5 min，收集上层有机相，减压浓缩后，上硅胶层析柱，用不同比例乙酸乙酯石油醚梯度洗脱，获得少许纯样品。样品用质谱和HPLC分析。HPLC检测条件：色谱柱：Agilent C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，检测波长254 nm，流动相为甲醇：水(75∶25)流速：1 mL/min，柱温：30 ℃。产物对映体过量值(e.e.)的测定使用手性色谱柱，分析条件为：Welch Amy-DR column(4.6×150 mm，5 μm)，流动相为乙腈：水(50∶50)，流速0.8 mL/min，柱温25 ℃，检测波长254 nm。e.e.值计算方式为：[A(s)-产物-A(R)-产物]/[A(s)-产物+A(R)-产物]×100%。A(s)-产物和A(R)-产物分别代表反应后(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇和(R)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的峰面积。

2结果与讨论

2.1GDH的表达与测活

pGDH-pET28a用NdeⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为5.4 kb和0.8 kb的两个片段，与预期结果相符，如图2所示。

将收集的菌体超声破碎，收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE分析，结果如图2所示，结果显示诱导后的上清中含有重组质粒的表达产物约30 kD，而未经诱导的菌体破碎液则不含该条带。

根据方法1.2.1，测得葡萄糖脱氢酶的酶活为81.2 U/ mL。一个酶活力单位(U)定义为在测定条件下，每分钟产生1 μmol产物所需的酶量。

1: DNA Marker；2:NdeⅠ/XhoⅠ双酶切验证质粒pGDH-pET28a；3:E.coliBL21-GDH未诱导破壁沉淀；4:E.coliBL21-GDH未诱导破壁上清液；5:E.coliBL21-GDH诱导后破壁沉淀；6:E.coliBL21-GDH诱导破壁上清液；7: 蛋白质Marker

图2质粒pGDH-pET28a的双酶切验证和GDH 的SDS-PAGE

2.2双质粒菌株的构建与共表达

pADH-pET21a用NdeⅠ/XhoⅠ双酶切鉴定，琼脂糖凝胶电泳检测，得到大小约为5.4 kb和0.8 kb的两个片段，与预期结果相符，如图3所示。

共表达菌株的菌体经超声破碎，收集上清与沉淀，进行SDS-PAGE分析，结果如图3所示，在30 kD和29 kD位置有明显的表达条带，与GDH 和ADH 预期大小相符。

1:NdeⅠ/XhoⅠ双酶切验证质粒pADH-pET21a；2: DNA Marker；3: 蛋白质Marker；4:E.coliBL21-ADH/GDH诱导后破壁上清液；5:E.coliBL21-ADH/GDH诱导后破壁沉淀; 6:E.coliBL21-ADH/GDH未诱导上清液；7:E.coliBL21-ADH/GDH未诱导沉淀

图3质粒pADH-pET21a的双酶切验证和ADH与GDH共表达的SDS-PAGE

2.3双酶偶联催化生成(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇

按方法1.2.3配制40 mL反应体系，考察在其他条件相对稳定的情况下温度对转化率的影响，转化分别在25 ℃、28 ℃、30 ℃、33 ℃ 和37 ℃条件进行下，转化24 h后取样检测，以最高组产率为100%，比较其他组所得相对产率如图4(A)所示，结果表明30 ℃为最适反应温度。同时考察了在30 ℃条件下，pH对转化率的影响，分别调节反应pH为5.0、6.0、7.0、8.0和9.0，转化24 h后取样检测，所得相对产率如图4(B)，结果表明pH 7.0为最适反应pH。

最佳转化条件下的反应体系经过24 h的反应，转化液(反应前后)取样经过乙酸乙酯萃取后进行HPLC检测，并与标准品对照(图5)。结果表明，24 h反应终止时，底物转化较为彻底，摩尔转化率为93.75%。图5D为反应产物经HPLC反相柱分析结果，2.4 min处为NADP(H)的吸收峰，5.4 min处为(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇产物。产物保留时间与标准品一致。

样品经过分离纯化后，使用质谱检测其分子量。产物的质谱数据，ESI-MS(m/z)：210[M+H]+与(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的分子量一致。手性色谱柱分析表明产物的(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇的e.e.值达到99%，催化酶对底物特异性较好，所转化出的产物具有比较高的光学纯度。

A：反应温度对转化率的影响

B：反应pH值对转化率的影响

A：2,6-二氯-3-氟苯乙酮标品；B：(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇标品；C：初始转化反应液；D：转化24 h反应液

图5(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇酶转化体系的HPLC检测

3结论

苯偶联酮基侧链的还原反应涉及到多种医药中间体的制备。使用共表达葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的粗酶液偶联催化，手性还原2,6-二氯-3-氟苯乙酮，制备药物中间体(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇，在6%的投料浓度下，可以获得转化率90%以上的(S)-1-(2,6-二氯-3-氟苯基)乙醇产物，转化体系简单,易于后续的产物分离。使用葡萄糖脱氢酶循环再生还原型辅酶，有效降低了酶法还原的成本，表现出较好的应用前景。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.002

基金项目：国家自然科学基金资助项目(81172962)，国家“重大新药创制”科技重大专项(2012ZX9301002003)。

作者简介：刘丽勤(1989～)，男，在读硕士研究生，E-mail：xiansengliu@163.com。 *通讯作者: 邵雷，男，副研究员，E-mail：feihusl@163.com。

Preparation of (S)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl) ethanol catalyzed by coupling glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase

LIU Li-qin1,2,ZHANG Jun-liang2,TAN Jun2,CHEN Dai-jie2,LI Ya-jun2,SHAO Lei2

1. College of Life and Environment Science, Shanghai Normal University, Shanghai 200234, China;2. State Key Laboratory of New Drug and Pharmaceutical Process, Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry,China State Institute of Pharmaceutical Industry, Shanghai 201203, China

Abstract(S)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl) ethanol is a chiral precursor of crizotinib, it can be prepared by catalytic reduction of 2,6-dichloro-3 fluoroacetophenone. CoenzymeⅡ regeneration is the technical bottleneck of the reaction. In this research，the recombinant E.coli BL21-ADH/GDH was constructed to realize the co expression of glucose dehydrogenase and alcohol dehydrogenase. For the catalytic reaction, E.coli BL21-ADH/GDH could significantly transfer 2,6-Dichloro-3-fluoroacetophenone to (S)-1-(2,6-two chlorine-3-fluorine phenyl) ethanol under the conditions of 30 ℃, pH 7 and 6% feeding amount. The transform rate was 93.75%.

Key wordscoenzyme regeneration; alcohol dehydrogenase; glucose dehydrogenase; (S)-1-(2,6-dichloro-3-fluorophenyl) ethanol