常压室温等离子体诱变高通量筛选N-乙酰氨基葡萄糖高产突变株

池亚斌，　顾　洋，　刘　龙, 2*，　李江华，　堵国成,2，　陈　坚,2

1. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122；2. 江南大学 糖化学与生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122



常压室温等离子体诱变高通量筛选N-乙酰氨基葡萄糖高产突变株

池亚斌1，顾洋1，刘龙1, 2*，李江华1，堵国成1,2，陈坚1,2

1. 江南大学 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 214122；2. 江南大学 糖化学与生物技术教育部重点实验室, 无锡 214122

摘要：采用新型常压室温等离子体(ARTP)诱变产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌BSGN6，并应用显色法和96孔板培养方法筛选N-乙酰氨基葡萄糖高产突变株。研究表明显色反应时添加四硼酸钾溶液1 μL、PDABA 125 μL、反应时间5 min、反应温度96 ℃时，N-乙酰氨基葡萄糖检测的准确度最高。通过多轮ARTP诱变及高通量筛选最终获得突变株(4A12)，3 L罐发酵GlcNAc产量达到36.14 g/L，较出发菌株(BSGN6)提高了65.32%。经过50次传代后性状稳定。ARTP诱变技术作为获得产N-乙酰氨基葡萄糖高产菌株的有效途径，与分子生物学手段相比，本方法更加快捷高效。

关键词：离子体(ARTP)诱变； N-乙酰氨基葡萄糖； 高通量筛选

N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)作为氨基葡萄糖(GlcN)的衍生物，被广泛应用于营养化学品和药品行业中[1]。GlcNAc能够提高内质网蛋白内稳态，因此能起到延长细胞寿命的作用[2]。研究表明，GlcNAc可以维持骨关节及软骨组织的健康，对治疗风湿性及类风湿性关节炎具有显著功效[3]。此外，GlcNAc也可以有效的治疗炎症性肠病[4]。随着人口老龄化的加剧以及GlcN和GlcNAc应用领域的延伸，其全球需求量将会继续增加。微生物发酵法因绿色、环保、不受原材料限制等优点将成为N-乙酰氨基葡萄糖的首选生产方法[5]。本研究室在前期研究中通过代谢工程改造技术，获得一株具有较高GlcNAc合成效率的枯草芽孢杆菌生产菌株BSGN6[2, 6, 7]。

常压室温等离子体(ARTP)生物诱变育种技术，因其具有射流温度低(25 ℃～35 ℃)、对环境和人体无害、设备操作简单等优势，目前已被广泛的应用于生物诱变育种领域[8]。研究表明，阿维链霉菌、发孢甲基变菌、酵母等微生物通过ARTP诱变，均能够成功筛选得到高产突变株[8]。

然而目前，尚未有使用ARTP技术诱变结合高通量筛选方法诱变筛选N-乙酰氨基葡萄糖高产突变菌的报道。本研究首次将ARTP诱变技术与96深孔板高通量筛选方法应用于筛选获得产N-乙酰氨基葡萄糖诱变高产菌，建立并优化高通量筛选方法，并利用该方法成功筛选得到一株N-乙酰氨基葡萄糖产量高、氮源转化效率高、葡萄糖转化效率高的突变株(4A12)。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株

产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌BSGN6

1.1.2培养基

(1)斜面培养基

蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂20 g/L；pH 7.0～7.2；灭菌121 ℃，15 min。

(2)种子培养基

蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L；pH 7.0～7.2；灭菌121 ℃，15 min。

(3)诱变筛选培养基 ① (g/L)：酵母粉12，蛋白胨6，硫酸铵6，K2HPO4·3H2O 12.5，KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 3，葡萄糖60(单独灭菌)，木糖5(单独灭菌)，15 mL微量元素溶液。

诱变筛选培养基 ②(g/L)：酵母粉2，蛋白胨1，硫酸铵1，K2HPO4·3H2O 12.5, KH2PO42.5，MgSO4·7H2O 3(单独灭菌)，葡萄糖60(单独灭菌)，木糖5(单独灭菌)，15 mL微量元素溶液。

(4)上罐发酵培养基(g/L)：酵母粉12，蛋白胨6，硫酸铵6，K2HPO4·3H2O 12.5, KH2PO42.5, MgSO4·7H2O 3，葡萄糖30(单独灭菌)，15 mL微量元素溶液。补料：葡萄糖800 g/L。115 ℃灭菌15 min。

(5)微量元素溶液(g/L)：CaCl24.0(单独灭菌),MnSO4·5H2O 1.0, CoCl2·6H2O 0.4, NaMoO4·2H2O 0.2, ZnSO4·7H2O 0.2, AlCl3·6H2O 0.1, CuCl2·H2O 0.1, H3BO40.05。

1.1.3培养条件

(1)斜面培养

挑取甘油管保藏菌种划线接种到斜面上进行活化，37 ℃恒温培养12 h左右。

(2)96深孔板种子培养

用无菌牙签将种子接至装有100 μL种子培养基的96浅孔板中，置于96板摇床，600 r/min，37 ℃震荡培养10 h。

(3)96深孔板发酵

取2 μL的种子接入装有600 μL的96深孔板板，置于96板摇床，900 r/min，37 ℃震荡培养48 h。

(4)摇瓶发酵种子培养

接一环经斜面活化的斜面种子到装有25 mL种子培养基的500 mL三角瓶，8层纱布封口，置于旋转式摇床上，220 r/min，37 ℃振荡培养10 h。

(5)摇瓶发酵培养

5℅的接种量将种子培养基接入装有95 mL发酵培养基的500 mL摇瓶，置于旋转式摇床上，220 r/min，37 ℃振荡培养48 h。

(6) 3 L发酵罐上补料发酵

以3%(v/v)接种量将活化好的种子液接至3 L发酵罐中，发酵罐装液量为1.5 L，培养温度为37 ℃。使用3 mol·L-1的盐酸溶液及25%(v/v)的氨水调节pH，使其维持7.0。通气量为1.5 vvm，初始搅拌转速600 r/min 。当菌体达到一定浓度(OD600为0.4时)，添加木糖(终浓度5 g·L-1)进行诱导。发酵培养基含20 μg·mL-1的卡纳霉素，葡萄糖初始溶度为20 g·L-1，采用反馈式葡萄糖流加(控制葡萄糖浓度在5 g·L-1)[9]。

1.2方法

1.2.1ARTP诱变操作

本研究使用ARTP对产GlcNAc基因工程菌BSGN6进行诱变处理，以高纯氦气作为工作气体。在电源功率100 W、气流量10 L/min、等离子体发射源照射样品距离2 mm对10 μL菌液(106～107)CFU个/mL进行处理,分别考察了5 s、10 s、15 s、20 s、25 s、30 s和60 s时细胞的致死率[8][10]。

致死率计算公式：

注：其中U为不经过诱变处理对照菌的总菌数；T为诱变处理后的总菌数。

1.2.2高通量筛选方法的建立

为了快速高效筛选到GlcNAc高产菌株，本研究建立了比色法高通量检测GlcNAc以及利用96深孔板高通量筛选的方法。高通量筛选方法流程如图1所示。首先将诱变后涂布平板上长出的菌落接种于96潜孔板中作为种子液，37 ℃培养10 h后，取2 μL转接至96深孔板诱变筛选培养基中，发酵培养48 h。发酵结束后，离心取2 μL上清液于96 PCR板中，加入43 μL超纯水以及1 μL四硼酸钾溶液(1.5 g四硼酸钾溶解于25 mL超纯水)后于96 ℃金属浴加热5 min，结束反应。取10 μL反应液于96浅孔板，向其中添加125 μL PDABA溶液(1 g对二甲基苯甲醛溶解于100 mL含1.25%盐酸的冰醋酸中)，于37 ℃ 96板摇床反应10 min，利用酶标仪测定A585处吸光值，吸光值与GlcNAc的含量成正相关。根据酶标仪测定的数据，在96浅板中找出最高产量对应的突变株，并将其作为下一轮出发菌株进行诱变处理。经过多轮诱变后，将最终初筛获得的高产菌株进行摇瓶验证。

图1　高通量筛选方法流程图

1.2.3GlcNAc的检测方法

GlcNAc的检测采用高效液相色谱法(HPLC)，检测条件如表1。

表1　HPLC法测定GlcNAc糖相关条件

2结果与讨论

2.1高通量筛选方法的建立

综合国内外报道，常用检测GlcNAc的方法有苯酚-硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法、DNS法、改进的Schales、Elson-Morgan、Reissig等。这些方法已经有研究者对其进行了深入的研究，研究发现Reissig方法具有灵敏度高，重复性好、稳定性好的特点[11]。因此在本研究中采用Reissig方法用来检测GlcNAc。然而在本实验中发现将Reissig方法终反应体系缩小至150 μL时，检测0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L和0.04 g/L的GlcNAc标样线性关系较差，R2只有0.8。因此本研究需要对该方法进行优化，使其能够在较小的应体系也能保证较高的准确性。

将0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L和0.04 g/L的GlcNAc标样线性关系R2值作为考察因素分别优化四硼酸钾添加量、PDABA添加量、反应时间及反应温度对，之后设计正交试验设计以确定最合适反应条件。

2.1.1四硼酸钾添加量的确定

为了确定合适的四硼酸钾添加量，本文首先单一考察了四硼酸钾添加量对显色反应的影响，向检测0.01 g/L、0.02 g/L、0.03 g/L和0.04 g/L的GlcNAc标样反应体系中各添加了1 μL、3 μL、5 μL、7 μL、9 μL、11 μL和13 μL的四硼酸钾。测定的R2如图所示，结果显示当添加3 μL时线性关系最佳，R2达到0.9。

2.1.2PDABA添加量的确定

PDABA的添加量对显色反应具有重要的影响，添加量不够会导致显色不充分。同时PDABA自身溶液呈黄色，添加过多也会影响吸光值的大小。本研究中考察了添加25 μL、50 μL、75 μL、100 μL、125 μL、150 μL和200 μL时对表样线性关系的影响。如图3所示，当PDABA添加量为125 μL时，线性关系最佳，R2达到0.91。

图2　四硼酸钾添加量对R2的影响

图3　PDABA添加量对R2的影响

2.1.3反应时间的确定

不同的反应时间也会造成显色的差异，反应时间过短，会造成显色不充分，测出的数值偏低。本研究中分别考察了1 min、3 min、5 min、7 min、9 min、11 min对显色反应的影响，如图4所示，反应时间为3 min左右时，效果最佳，R2达到0.88。

2.1.4反应温度的确定

Reissig方法中反应条件是沸水浴，为了方便操作，在本实验中我们采用的是96 PCR板金属浴。因此需要确定最佳反应温度，我们研究了90 ℃、91 ℃、92 ℃、93 ℃、94 ℃、95 ℃、96 ℃、97 ℃、98 ℃、99 ℃和100 ℃对显色反应的影响。结果显示，反应温度为96 ℃时效果较好。

图4　反应时间对R2的影响

图5　反应温度对R2的影响

2.1.5正交试验设计

四硼酸钾添加量、PDABA添加量、反应时间及反应温度4个因素，以R2为指标，选用L9(34)正交表进行正交试验[12]，各水平因素见表2-1。设计9组试验，各组试验结果及方差分析表见表2-2及表2-3。由正交试验结果可知，最佳组合为：四硼酸钾添加量1 μL、PDABA添加量125 μL、反应时间3 min、反应温度95 ℃，与单因素组合优化的产量相比相差不大。

表2-1　各因素水平表

2.2ARTP致死率曲线测定

根据1.3所述对产GlcNAc工程菌BSGN6的ARTP致死率进行测定，致死率曲线如图6所示。

从图6可以看出，当ARTP诱变处理时间为10 s时，致死率可以达到98%。有研究表明，将致死率控制在95%～99%之间，可有利于获得正向突变菌株。因此在本研究中，我们将诱变处理时间设定为10 s。

表2-2　R2正交试验结果

表2-3　试验结果方差分析表

图6　BSGN6的ARTP致死曲线

2.3高氮源转化率突变株的筛选

为了筛选获得氮源转化效率提高的突变菌株，我们设计了诱变筛选培养基 ②。在该培养基中，碳源(葡萄糖)含量过剩，以保证氮源全部被消耗完。同时根据材料与方法1.4所述，经过多轮诱变处理，初筛共筛选出24株较对照菌提高的正向突变菌株。

随后我们对这24株菌进行摇瓶验证，摇瓶验证也使用是诱变筛选培养基 ②。摇瓶发酵48 h后，将发酵液离心取上清液通过高效液相色谱法检测GlcNAc含量。如图7所示，突变菌(5H7)在相同的条件下GlcNAc产量最高达到了4.75 g/L，较对照菌株BSGN6(3.25 g/L)相比提高了46.15%。

图7　菌株BSGN6与突变菌株摇瓶发酵GlcNAc产量对比

2.4高葡萄糖转化率突变株的筛选

我们将之前获得氮源转化效率最高突变菌(5H7)进一步诱变，以期获得葡萄糖转化效率高的突变菌。在这里我们采用诱变筛选培养基①，该培养基中氮源含量丰富，以保证碳源(葡萄糖)消耗完全。采用与之前相同的诱变条件，经过多轮诱变，初筛最终获得18株正向突变菌株。

摇瓶验证结果如图8所示，其中突变菌(4A12)的GlcNAc产量达到9.12 g/L,较出发菌株(5H7)7.6 g/L相比提高了20%，突变菌(4A12)的葡萄糖转化效率达到0.169 g GlcNAc/g Glucose。

2.53L罐发酵考察突变菌(4A12)发酵特性

我们以出发菌株BSGN6作为对照菌，在相同条件下发酵培养72 h考察突变株4A12在3 L罐发酵中的培养特性。从图中可知，突变菌(4A12)最高产量达到36.14 g/L，较出发菌株(21.86 g/L)提高了65.32%。整个发酵过程来看，突变菌的生物量都要低于发菌株，突变菌株最大菌体量为21.56 g/L,仅为出发菌株(25.62 g/L)的84.2%。

图8　菌株5H7与突变株摇瓶发酵GlcNAc产量对比

注：菌株BSGN6与突变株4A12在3 L罐中GlcNAc发酵结果

注：菌株BSGN6与突变株4A12在3 L罐中菌体生长情况

2.6突变菌遗传稳定性研究

为了考察突变菌4A12的遗传稳定性，我们先将突变菌在固体培养基平板活化，然后转接至液体种子培养基进行培养，后转接至发酵培养基进行摇瓶发酵。同时继续传代，整个过程一共传代培养50次。突变菌生产GlcNAc能力的稳定性结果如图10所示。

从图中可以看出突变菌4A12具有良好的遗传稳定性，摇瓶发酵GlcNAc的产量维持在9 g/L左右。

3结论

本研究首次将ARTP诱变技术应用于高通量筛选产GlcNAc突变菌，同时并建立并优化了高通量比色法检测GlcNAc筛选方法，研究表明当添加四硼酸钾溶液添1 μL、PDABA 125 μL、反应时间5 min、反应温度96 ℃时，N-乙酰氨基葡萄糖检测的准确度最高。

图10　突变菌株4A12遗传稳定性

同时本研究通过建立的筛选方法利用不同的筛选培养基成功筛选获得一株GlcNAc产量高、氮源转化效率高、葡萄糖转化效率高的突变株(4A12)，摇瓶发酵GlcNAc产量达到9.12 g/L，葡萄糖转化效率达到0.169 g GlcNAc/g Glucose。3 L罐发酵GlcNAc产量达到36.14 g/L，较出发菌株(21.86 g/L)提高了65.32%。之后我们也考察了突变株遗传稳定性，通过传代实验，GlcNAc摇瓶产量维持在9 g/L左右，表明经ARTP诱变获得这株突变菌(4A12)遗传稳定性较好。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.003

基金项目：“江苏省产学研联合创新资金-前瞻性联合研究项目”(项目编号：BY2012054)。

作者简介：池亚斌(1990～)，男，硕士生。E-mail：1041507916@qq.com。 *通讯作者: 刘龙教授。Tel：0510-85918312，E-mail: longliu@jiangnan.edu.cn。

High-throughput screening of Bacillus subtilis for N-acetylglucosamine production by ARTP mutation technology

CHI Ya-bin1, GU Yang1, LIU Long1,2, LI Jiang-hua1, DU Guo-cheng1, 2, CHEN Jian1, 2

1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;2. Key Laboratory of Carbohydrate and Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China

AbstractA novel atmospheric and room temperature plasma (ARTP) mutagenesis system was used by combining with the high throughput screening of 96-well microplates and chromogenic reaction to obtain high-yielding mutants. The optimum conditions for chromogenic reaction were as follows: otassium tetraborate solution 1 μL, PDABA 125 μL, reaction time 5 min, temperature 96 ℃. Through several rounds of ARTP mutation and high-throughput screening, a mutant (4A12) was obtained. In 3 L fermentor, the maximum GlcNAc production reached 36.14 g/L, which improved 65.32% compared with that of the control strain BSGN6. The results of subculture test showed that the mutant strain had stable hereditary characteristics after 50 generations. ARTP mutagenesis technique as an effective way to obtain high-yielding GlcNAc strains was better than molecular biology methods.

Key wordsARTP; GlcNAc; high-throughput screening