大孔树脂固定化磷脂酶D

刘倩倩，　邱永乾，　刘炯钦，　孙建安，　薛长湖，　毛相朝

中国海洋大学食品科学与工程学院， 山东 青岛 276000



大孔树脂固定化磷脂酶D

刘倩倩，邱永乾，刘炯钦，孙建安*，薛长湖，毛相朝

中国海洋大学食品科学与工程学院， 山东 青岛 276000

摘要：磷脂酶D( PhospholipaseD, EC3.1.4.4 , PLD)是催化磷酸酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称。利用PLD的转碱基作用是目前催化合成磷脂酰丝氨酸(PS)的最佳途径。本实验以5种大孔树脂为载体固定化磷脂酶D(PLD)进行了研究。以酶回收率为主要指标，选择了最佳载体和优化了固定化条件。结果表明：非极性阳离子交换树脂H103是最佳固定化载体；其最优固定化条件：加酶液量1.2 mL，固定时间80 min，pH 6.0柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲液浓度为10 mmol/L。最佳固定化条件下，固定化之后的PLD比游离PLD酶活提高了三倍。

关键词：磷脂酶D； 固定化； 大孔树脂

磷脂(PL)是一种两亲水脂分子，含有一个亲水性的磷酸酯(hydrophilic head)和两个疏水性的长链脂肪酸(hydrophobic tail)[1]。磷脂是细胞膜的重要成分，在植物种子、禽类的蛋黄动物内脏及大脑中含量丰富，具有保湿、乳化、抗氧化等生理功能[2]。磷脂狭义上是指磷脂酰胆碱(Phosphatidyleholin, PC)，广义上是磷脂类混合物的总称。根据磷脂所含有磷脂酰基的不同可将磷脂分为：磷脂酰胆碱(Phosphatidylcholine,PC)、磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl-ethanolamin,PE)、磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol,PL)、磷脂酸丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)、磷脂酰甘油(Phosphatidylglycero,PG)和神经鞘磷脂(Springmyehn,SM)[3]。磷脂酰丝氨酸(PS)是磷脂中一种天然的稀有磷脂，能控制和调节细胞膜关键蛋白的功能状态[4]，维持细胞的内部环境，在信号转导以及分泌小泡释放中具有重要作用[5]。临床研究表明，PS具有重要的营养和生理功能，特别是在预防阿尔茨海默氏痴呆，改善记忆，提高警惕和关注，缓解抑郁和减少压力等方面[6, 7]。磷脂酰丝氨酸(PS)是一种尤其重要的磷脂，对生命活动的进行具有重要的作用，但是自然界中PS含量很低，目前获得PS的方法主要是生物提取法和酶转化法。早期的PS主要从植物种子和动物细胞中提取，但是植物种子中的PS含量极低，提取法主要是集中在动物组织大脑和肝脏等。最近几年，由于疯牛病[8]的影响，从动物组织中提取PS，受到人们的质疑[9]。酶转化法制备PS主要是利用天然的大豆磷脂和丝氨酸为底物，在磷脂酶D的催化作用下，通过磷脂酶D的转酰基作用合成PS[10, 11]，与生物提取法相比，生物酶法反应条件温和，无污染，产品安全等优点，目前PS合成主要使用生物酶法。

磷脂酶D( Phospholipase D, EC3,1.4.4, 缩写为PLD)，是能够催化磷酸酯键水解以及碱基交换反应能力的一类酶的总称[12]。磷脂酶D具有广泛的底物特异性，能够合成各种稀有磷脂，例如磷脂酰甘油，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇以及一些人工稀有磷脂等[13-15]，它广泛存在于动物，植物，及各种微生物如酵母、细菌中。早在1947年，Hanahan 和Chaikoff[16]等人在胡萝卜中首次发现了PLD，随后研究者又相继在白菜、花生、棉子中发现了PLD的踪迹。动物PLD主要分布在脑、肝脏等器官中，植物PLD主要分布在植物种子、根等组织中。微生物源的PLD由于其来源广泛、水解及转酯活性较高，因而是获得PLD的最佳途径。目前，已报道的产磷脂酶D的微生物种类繁多，主要有链霉菌(Streptomyces)、棒状杆菌(Corynebacterium)、大肠杆菌(Escherichia)、沙门氏杆菌(Salmonella)以及假单胞菌(Pseudomonas)等[17]。

本文主要对实验室保藏菌种Acinetobacterradioresistensa2产生的PLD游离酶进行了固定化，实验利用了5种大孔树脂，通过对固定化载体，pH，固定化时间，载样量以及缓冲液离子浓度的优化，确定了最佳固定化条件为：非极性阳离子交换树脂H103是最佳固定化载体，固定时间80 min，加酶液量1.2 mL，pH 6.0的柠檬酸-柠檬酸钠的缓冲液浓度为10 mmol/L。最后在不同pH条件下，比较了游离PLD和固定化PLD的酶活回收率，在固定化之后，PLD的酶活回收率提高了三倍。

1材料与方法

1.1实验材料

菌株：Acinetobacterradioresistensa2 由本实验室筛选保藏。

1.2主要试剂

胆碱氧化酶，辣根过氧化物酶，氯化胆碱，Tris，EDTA，4-氨基安替吡啉，95%PC，曲拉通-100，乙醚。

培养基配方：

种子培养基(%)：蛋白胨 1，酵母粉0.5，NaCl 1，pH 7.4，121 ℃灭菌20 min。

发酵培养基(%)：蛋白胨 1， NaCl 0.3，MgSO4·7H2O 0.05，CaCl20.1，pH 6.5，蒸汽灭菌20 min冷却后加入新鲜蛋黄2 mL。

1.3实验方法

1.3.1微生物培养及发酵基质的准备

将菌种活化后接种于种子培养基中，以10%的接种量于发酵培养基中，28 ℃，180 r/min震荡培养168 h。

1.3.2酶液制备

将发酵液离心(10 000 r/min，4 ℃，15 min)，收集离心液并以0.22 μm膜过滤，即为粗酶液。

1.3.3PLD酶活性测定方法

酶联比色法是利用PLD水解PC产生胆碱，胆碱在胆碱氧化酶和过氧化物酶的作用下形成红色显色物质，在500 nm 处有最大吸收峰。由于胆碱氧化酶和过氧化物酶价格昂贵，在参考Imamura and Horiuti[18]方法下做了稍微的修改。PLD酶活性定义为在此反应条件下，每min水解产生1 μmol胆碱所需要的酶量为一个酶活单位。

1.3.4固定化载体的选择及固定化条件优化

1.3.4.1固定化载体处理

固定化载体的预处理：分别取AB-8 、NKA-9、 H103 、D101、D301各0.1 g，分别置于6 mL亲和层析柱中，依次加入5倍体积的0.5 mol/L HCl、5倍体积的0.5 mol/L NaOH、5倍体积的0.5 mol/L HCl进行洗脱，最后用pH 6.0 0.02 mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(CPBS)进行5倍体积洗脱。各取1.3.2处理过的酶液1.0 mL与上述处理过的大孔树脂混合，并分别加入pH 6.0 0.02 mol/L的CPBS缓冲液0.3 mL，置于摇床(4 ℃，120 r/min)吸附1 h，之后取出，将上清液放出并收集，吸附后的载体用上述CPBS缓冲溶液5倍体积洗涤，重复三次进行平行实验。分别测定固定化酶的酶活力，计算酶活回收率并以之为指标，选择具有较高酶活回收率的载体进行优化，并得出最佳固定化条件。

1.3.4.2固定化pH选择

准确称取固定化效果最佳的载体0.1g每份，按照1.3.4.1中所述方法进行预处理。之后分别用浓度20 mmol/L的 pH 5.0 NaAc-HAC、pH 6.0的PBS、pH 6.0 CPBS、pH 7.0 Tris-HCl、pH 8.0的Tris-HCl进行5倍体积洗脱。准确量取处理过的酶液1.0 mL与上述处理过的大孔树脂进行混合，并分别对应加入上述缓冲液0.3 mL，置于摇床(4 ℃，120 r/min)吸附60 min后取出，将上清液放出，吸附后的载体再对应用上述缓冲溶液5倍体积洗涤，重复三次进行平行实验，最后分别测定固定化酶的水解活力，然后计算酶活回收率，并以之为指标进行衡量。

1.3.4.3固定化条件优化

根据1.3.4.1、1.3.4.2结果选择最优载体及最佳缓冲液pH，然后从固定时间、载体载量、缓冲液浓度三个方面对固定化条件进行优化。

(1) 固定化时间优化

准确称取最优载体0.1 g，按照1.3.4.1中所述方法进行预处理。取1.3.2处理过的酶液1.0 mL与上述处理过的大孔树脂混合，并分别加入pH 6.0的0.02 mol/L的CPBS缓冲液0.3 mL，置于摇床(4 ℃，120 r/min)上分别吸附30 min、60 min、70 min、80 min、90 min后取出，将上清液放出，吸附后的载体用上述CPBS缓冲溶液5倍体积洗涤，分别测定固定化酶的酶活力，重复三次进行平行实验，然后计算酶回收率。

(2) 固定化酶液量优化

准确称取最优载体 0.1 g，按照1.3.4.1中所述方法进行预处理。分别取1.3.2处理过的酶液0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.5 mL、2.0 mL与上述处理过的大孔树脂混合，并加入超纯水补足2.0 mL，并分别加入pH 6.0的0.02 mol/L的CPBS缓冲液0.3 mL。置于摇床(4 ℃，120 r/min)上吸附60 min后取出，将上清液放出，吸附后的载体用上述CPBS缓冲溶液5倍体积洗涤，分别测定固定化酶的酶活力，重复三次进行平行实验，计算酶回收率。

(3) 缓冲液浓度优化

准确称取最优载体0.1 g，按照1.3.4.1中所述方法进行预处理。在用缓冲液洗脱的时候，分别用超纯水、pH 6.0的1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L的CPBS缓冲液进行5倍体积洗脱。分别取1.3.2处理过的酶液1.0 mL与上述处理过的大孔树脂混合之后再相应加入超纯水、pH 6.0的1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L的CPBS缓冲液各0.3 mL，置于摇床(4 ℃，120 r/min)上吸附60 min后取出，将上清液放出，吸附后的载体用上述CPBS缓冲溶液5倍体积洗涤，测定固定化酶的酶活力，重复三次进行平行实验。

2结果与讨论

2.1固定化载体的选择

固定化载体的理化性质对固定化效率及固定化酶催化能力有重要影响[23]。从图1中可以发现在同等处理条件下的固定化效果，阳离子交换树脂>吸附树脂>阴离子交换树脂。H103效果最好，其次是D101、H103 、D101均为非极性阳离子交换树脂，固定化时加入pH 6.0的CPBS缓冲液，在该体系中阳离子交换树脂的活性基团更易与PLD完成交换。由表1发现，H103与D101相比，平均孔径较小，但比表面积较大，这使在相同固定条件下单位载体量的H103固定化效果更好。

表1　固定化载体性质

图1　不同树脂对PLD固定化效果的影响

2.2固定化pH选择

磷脂酶D的理论等电点是9.5，因而在上述对应pH条件下，磷脂酶D均带正电荷。图2表明PLD固定化的最适pH及缓冲液为pH 6.0的CPBS缓冲液，这可能是因为CPBS缓冲液使酶分子和大孔树脂的相互作用增强。

图2　不同pH对PLD固定化效果的影响

2.3固定化条件优化

2.3.1固定化时间优化

图3是固定化时间对PLD固定化的影响，表明随着固定化时间的不断延长，固定化酶的比活逐渐增加，当固定化时间是80 min时，酶活回收率最高，达到了97.99%。当时间继续增至90 min时，酶活回收率降至71.69%。这可能是由于吸附时间过长而导致部分PLD失活，另一方面载体结合过多的酶时，其孔道被堵塞而导致酶蛋白分子相互屏蔽，与底物契合的酶数量减少[19]。因而固定化时间最优为80 min，这与文献[20]报道的大孔树脂固定假丝酵母脂肪酶的固定化酶活最佳时间为(60～90)min相吻合。

图3　固定化时间对PLD固定化效果的影响

2.3.2载体载量优化

由图4发现随着酶液量的逐渐增加，固定化酶活回收率呈上升趋势，当酶液量为1.2 mL时，固定化酶活和活力回收达到了最高(分别为82.13 U、97.77%)，然后随着酶液量的进一步升高，固定化酶活和活力回收又分别降低至74.95 U、89.22%。单位质量的载体固定的酶量是一定的，所以随着酶液量的增加，酶活力回收率反而下降。由此我们可以确定1.2 mL是固定化酶的最佳酶液量。

图4　酶液量对固定化效果的影响

2.3.3CPBS缓冲液离子强度优化

缓冲液离子强度也是PLD固定化的重要影响因素之一。在图5中，我们发现随着离子强度的增加，固定化酶的比活及酶活回收率呈上升趋势，在10 mmol/L，pH 6.0条件下固定化效果最好，酶活及酶活回收率分别达到了78.44 U、93.38%，这可能是因为离子强度过高，可能会产生某种电荷屏蔽作用，致使底物分子不能接近酶的活性中心，因而酶的催化效率会降低，而合适的离子浓度会促进酶与底物分子的结合。

图5　CPBS离子强度对固定化效果的影响

2.4固定化和游离PLD比较

pH对固定化酶及游离酶活性的影响见图6，以pH为7.0时的酶活为100%计算，由图我们可发现二者的最适pH均为7.0，但是固定化酶在pH 5.0～8.0时活性都比较好，而游离酶只在pH 7.0～8.0范围内保持较好的活力，这表明与游离酶相比，固定化酶受环境pH值的影响较小，适用的pH范围较广。在pH 6的条件下，固定化PLD的活力比游离PLD提高了三倍。

图6　不同pH值下固定化酶及游离酶的相对酶活

3结论

以酶活回收率为主要指标，选择H103作为固定化载体。并在此基础上进行固定化条件优化，综合固定化时间、酶液量、缓冲液浓度因素进行的单因素考察的结果，发现固定化最佳条件是固定时间为80 min，酶液量1.2 mL，pH 6.0浓度为10 mmol/L的CPBS缓冲液。与游离酶相比，固定化酶受环境pH值的影响较小，适用的pH范围较广。在pH 6的条件下，固定化PLD的活力比游离PLD提高了三倍。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.005

基金项目：山东省科技重大专项：海洋食品现代加工与产业链质量控制体系研究(2015ZDZX05003)；青岛市市南区科技发展资金：虾头中功能物质的生物转化技术及活性评价(2014-14-002-SW)；中央高校基本科研业务费专项基金：海洋生物酶工程平台技术及应用(201564018)。

作者简介：刘倩倩(1989～)，女，研究生。E-mail: 15253231129@163.com。 *通讯作者: 孙建安(1984～)，男，工学博士，讲师，主要从事水产资源的酶催化转化研究。E-mail:: sunjianan@ouc.edu.cn。

Immobilization of phospholipase D by macroporous resin

LIU Qian-qian, QIU Yong-qian, LIU Jiong-qin, SUN Jian-an , XUE Chang-hu, MAO Xiang-zhao

Food science and engineering, Ocean university of China, Shandong, Qingdao, 276000

AbstractPhospholipase D (PLD) generally defined as a kind of enzyme catalyzes PC to generate choline and PA. PLD transacylation is currently the best way for catalytic synthesis of phosphatidylserine. In this study, five kinds of macroporous resin were chosen to immobilize phospholipase D. The enzyme recovery activity was served as the main indexes, then the optimum carrier was confirmed and the immobilized conditions were optimized. The results showed that the nonpolar H103 was the best carrier and the optimum conditions for immobilized PLD were as follows: the amount of enzyme solution 1.2 mL, pH 6.0 of citric acid-sodium citrate buffer 10 mmol/L and immobilized for 80 minutes. Under the optimized conditions, the immobilized PLD displayed the highest activity, which was three times than that of the free PLD.

Key wordsphospholipase D; immobilization; macroporous resin