发酵性丝孢酵母胞内脂肪酶与蛋白酶性质的研究

许燕博,　王　迪,　侯英敏,　孙玉梅,　王宁涵

大连工业大学生物工程学院，大连市 116034



发酵性丝孢酵母胞内脂肪酶与蛋白酶性质的研究

许燕博,王迪,侯英敏,孙玉梅*,王宁涵

大连工业大学生物工程学院，大连市 116034

摘要：为了探讨发酵性丝孢酵母胞内脂肪酶和蛋白酶的潜在应用，通过超声波破碎细胞获得胞内酶，研究了温度、pH、金属离子、有机溶剂、表面活性剂、蔗糖、淀粉、酪蛋白对粗酶液的酶活力的影响。研究结果表明，两种酶的最适反应条件均为55 ℃、pH中性；5 mmol/L的金属离子Ca2+、Mn2+降低了脂肪酶活力，而提高了蛋白酶的活力；20%(v/v)甲醇、乙醇、异丙醇、正己烷、甲苯对脂肪酶均具有激活作用，其中正己烷激活作用最大；而所试有机溶剂均严重抑制蛋白酶活力；0.01%(v/v)TritonX-100和蔗糖7.5%(w/v)对脂肪酶和蛋白酶均具有激活作用，0.5%(w/v)可溶性淀粉和1%～2.5%(w/v)酪蛋白均能提高脂肪酶活力且降低蛋白酶活力。这些特性使发酵性丝孢酵母胞内脂肪酶和蛋白酶应用于洗涤剂具有可能性。

关键词：发酵性丝孢酵母； 脂肪酶； 蛋白酶； 酶学性质

微生物脂肪酶和蛋白酶被广泛应用于化工、医药、食品等领域。有些工业生产需要脂肪酶和蛋白酶的共同作用，比如：洗涤剂中同时添加脂肪酶和蛋白酶可以起到更好的去污效果[1]，皮革软化需要脂肪酶和蛋白酶共同作用才能达到理想效果[2]，肉制品加工中脂肪酶和蛋白酶可促进风味物质的产生等[3]。

能单独产脂肪酶和蛋白酶的微生物较多，而假单胞菌属、芽孢杆菌属、青霉菌属、丝孢酵母属等微生物能同时产脂肪酶和蛋白酶[1,3-5]。利用微生物同时生产脂肪酶和蛋白酶，可通过一次发酵生产过程满足同时需要两种酶的应用领域的需求，比单独生产两种酶的成本要低。

通过菌种筛选并优化发酵条件，提高了相关微生物同时产脂肪酶和蛋白酶的能力[1,3-5]。为了使脂肪酶和蛋白酶能更好用于实际生产，必须了解二者的酶学性质。目前仅对绿脓假单胞菌和地衣芽孢杆菌所产脂肪酶及蛋白酶的酶学性质研究比较全面，包括温度、pH、储存条件、变性剂、氧化剂、有机溶剂、表面活性剂、金属螯合剂等对酶活的影响[1,4]。发酵性丝孢酵母能产油脂和脂肪酶[6-9]，目前尚无关于其所产脂肪酶的酶学性质以及产蛋白酶的报道。

本文对发酵性丝孢酵母脂肪酶与蛋白酶酶学性质进行了较系统的研究，包括温度、pH、金属离子、有机溶剂、表面活性剂、蔗糖、淀粉、酪蛋白对酶活力的影响，为开发该菌胞内脂肪酶和蛋白酶的工业应用提供了可能性。

1材料与方法

1.1菌种

发酵性丝孢酵母(Trichosporonfermentans)CICC1368：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2培养基

固体斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉10，蛋白胨10，琼脂20，pH自然。

种子培养基(g/L)：葡萄糖100.0，蛋白胨5.3，酵母粉2.0，尿素2.0，MgSO4·7H2O 0.5，pH自然。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖100.0，蛋白胨1.8，酵母粉0.5，KH2PO42.0，植物油8.5，吐温-80 4.6，pH自然。

1.3实验方法

1.3.1细胞的培养

将4 ℃保存的发酵性丝孢酵母菌种接种于固体斜面培养基上，于30 ℃培养48 h。取斜面培养的菌丝接入种子培养基中，于30 ℃、160 r/min 摇床培养24 h。向发酵培养基中接入10%(v/v)的种子液，于30 ℃、160 r/min摇床发酵60 h。

1.3.2粗酶液的制备

发酵液于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，收集菌体，用0.067 mol/L、pH 6.8的磷酸盐缓冲液洗涤菌体3次，离心收集菌体。称取1 g收集所得的菌体与25 mL磷酸盐缓冲液混合，于冰水浴中进行超声波破碎(550 w，6 s/5 s，5.5 min)，将细胞破碎液于4 ℃、10 000 r/min离心10 min，收集上清液，上清液即为粗酶液。

1.3.3脂肪酶活力测定

采用酸碱滴定法[10]测定脂肪酶活力。

脂肪酶活力定义：在38 ℃、pH 6.8的反应条件下，将每分钟脂肪酶催化橄榄油水解产生1 μmol脂肪酸所需酶量定义为一个脂肪酶活力单位。发酵60 h时，脂肪酶活力为84.1 U/g。

1.3.4蛋白酶活力测定

采用福林法[11]测定蛋白酶活力。

蛋白酶活力定义：在40 ℃、pH 6.8的反应条件下，将每分钟蛋白酶催化酪蛋白水解产生1 mg酪氨酸所需酶量定义为一个蛋白酶活力单位。发酵60 h时，蛋白酶活力为308.8 U/g。

1.3.5反应温度、反应pH值对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

分别将粗酶液置于不同温度、pH下测定脂肪酶和蛋白酶活力。

1.3.6金属离子对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

在粗酶液中分别加入终浓度5 mmol/L的各种金属离子盐溶液(CaSO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、MnSO4·H2O)，室温保存30 min，在各自最适条件下，测定其脂肪酶和蛋白酶活力。以未经金属离子盐溶液处理的粗酶液为对照，将最适反应条件下脂肪酶和蛋白酶活力各自定义为100%。

1.3.7有机溶剂对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

分别将粗酶液与有机溶剂乙醇、异丙醇、甲苯、甲醇、正丁醇、乙腈、正己烷、环己烷按体积比4∶1混合，于37 ℃、160 r/min条件下处理30 min，恢复至室温，在各自最适条件下，测定其脂肪酶和蛋白酶活力。以未经有机溶剂处理的粗酶液为对照，将最适反应条件下脂肪酶和蛋白酶活力各自定义为100%。

1.3.8表面活性剂对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

在粗酶液中分别加入终浓度0.01%(v/v)的表面活性剂TritonX-100、Tween-40、Tween-80、CTAB、SDS，室温保存30 min，在各自最适条件下，测定其脂肪酶和蛋白酶活力。以未经表面活性剂处理的粗酶液为对照，将最适反应条件下脂肪酶和蛋白酶活力各自定义为100%。

1.3.9酶保护剂对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

向粗酶液中分别加入终浓度为1%～10%(w/v)的蔗糖、0.5%～5%(w/v)的可溶性淀粉、0.5%～5%(w/v)的酪蛋白，于4 ℃贮存20 h，恢复至室温，在各自最适条件下，测定其脂肪酶和蛋白酶活力。以未经蔗糖、可溶性淀粉、酪蛋白处理的粗酶液为对照，将最适反应条件下脂肪酶和蛋白酶活力各自定义为100%。

2结果

2.1反应温度对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

在20 ℃～60 ℃的不同温度下，分别测定粗酶液的脂肪酶和蛋白酶活力，将最适温度下的脂肪酶和蛋白酶活力各自定义为100%，由图1可知，温度低于55 ℃时，酶活随反应温度的升高而增大，在55 ℃时脂肪酶和蛋白酶的活力均达到最大值。55 ℃～60 ℃时，酶活迅速下降。粗酶液的脂肪酶和蛋白酶的最适温度均为55 ℃。

2.2反应pH值对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

在反应体系中加入不同pH的磷酸盐缓冲液，在各自最适反应温度下，测定粗酶液的脂肪酶和蛋白酶活力，将最适pH条件下脂肪酶和蛋白酶活力各自定义为100%，由图2可知，脂肪酶在酸性和碱性环境中的酶活均较低，其最适反应pH为6.8。而蛋白酶最适pH作用范围较大，在pH 7～9均能维持较高酶活力，其最适反应pH为7.0。

图1　反应温度对脂肪酶和蛋白酶活力的影响

图2　反应pH值对脂肪酶和蛋白酶活力的影响

2.3金属离子对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

由图3可知，终浓度为5 mmol/L的Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+对脂肪酶均表现出不同程度的抑制作用；除Ca2+、Mn2+外，其余金属离子对蛋白酶亦表现出不同程度的抑制作用；Ca2+对蛋白酶具有明显的激活作用，使其活力提高了72.19%，且完全抑制脂肪酶。

图3　金属离子对脂肪酶和蛋白酶活力的影响

2.4有机溶剂对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

由图4可知，除正丁醇、乙腈、环己烷对脂肪酶起抑制作用外，其余有机溶剂对脂肪酶均具有激活作用，其中正己烷、异丙醇的激活作用最明显，使脂肪酶活力提高120%以上；上述有机溶剂对蛋白酶均具有不同程度的抑制作用，其中甲醇、乙醇、正丁醇、乙腈、正己烷均完全抑制蛋白酶。

图4　有机溶剂对脂肪酶和蛋白酶活力的影响

2.5表面活性剂对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

由图5可知，TritonX-100对脂肪酶和蛋白酶的激活作用最明显，使两种酶的相对酶活分别提高了112.19%和23.03%。除CTAB作用不显著外，其余表面活性剂对脂肪酶均具有激活作用，使脂肪酶的相对酶活均提高了70%以上；CTAB和SDS对蛋白酶具有抑制作用，Tween-40和Tween-80对蛋白酶无明显作用，蛋白酶活力保持不变。因此，添加TritonX-100、Tween-40、Tween-80有利于脂肪酶和蛋白酶的同时应用。

图5　表面活性剂对脂肪酶和蛋白酶活力的影响

2.6酶保护剂对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

2.6.1蔗糖对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

由图6可知，蔗糖浓度小于7.5%(w/v)时，脂肪酶活力随着蔗糖浓度的增加呈上升趋势；蔗糖浓度为7.5%(w/v)的脂肪酶活力达到最大，相对酶活力为205.71%；蔗糖浓度大于7.5%(w/v)时，脂肪酶活力随着蔗糖浓度的增加而下降。蛋白酶活力随蔗糖浓度的增加呈小幅波动性变化，蔗糖浓度为7.5%(w/v)的蛋白酶活力达到最大，相对酶活力为137.55%。因此，蔗糖作为两种酶保护剂的适宜浓度为7.5%(w/v)。

图6　蔗糖浓度对脂肪酶和蛋白酶活力的影响

2.6.2可溶性淀粉对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

由图7可知，随着可溶性淀粉浓度的增加脂肪酶活力逐渐降低，而蛋白酶活力不断增加；可溶性淀粉对脂肪酶的保护作用的降低，可能与蛋白酶活力的增加有关；淀粉浓度为0.5%(w/v)的脂肪酶相对酶活达到最大为158.9%。因此，淀粉作为脂肪酶保护剂适宜的浓度为0.5%(w/v)。

图7　可溶性淀粉浓度对脂肪酶和蛋白酶活力的影响

2.6.3酪蛋白对脂肪酶与蛋白酶活力的影响

由图8可知，酪蛋白浓度小于1%(w/v)时，随着酪蛋白浓度的增加，脂肪酶活力显著增加；酪蛋白浓度为1%～2.5%(w/v)的脂肪酶活力最大，相对酶活增加了约96%；酪蛋白浓度大于2.5%(w/v)时，脂肪酶活力随着酪蛋白浓度的增加呈下降趋势。蛋白酶活力随酪蛋白浓度的增加显著下降，大于2.5%(w/v)的酪蛋白浓度可使蛋白酶完全丧失活力。因此，酪蛋白作为脂肪酶保护剂的适宜浓度为1%～2.5%(w/v)。

图8　酪蛋白浓度对脂肪酶和蛋白酶活力的影响

3讨论

研究脂肪酶和蛋白酶的酶学性质对于评估其工业应用具有重要的作用。作为洗涤剂添加剂，酶制剂要耐受高温和碱性环境。目前常用来生产酶制剂的地衣芽孢杆菌脂肪酶和蛋白酶的最适反应温度分别为55 ℃和45 ℃，最适反应pH均为9[4]；绿脓假单胞菌脂肪酶和蛋白酶的最适反应温度分别为70 ℃和60 ℃，最适反应pH分别为11和9[1]。与这两种菌相比，发酵性丝孢酵母脂肪酶和蛋白酶均有良好的耐高温能力，蛋白酶耐碱性良好，而脂肪酶的耐碱能力较差。

酶制剂除了要耐高温耐碱以外，还要耐受洗涤剂及其中添加的一些成分(比如助溶剂等)[12]以及洗涤用水中的一些成分(比如金属离子等)。绿脓假单胞菌脂肪酶和蛋白酶在2%(v/v)TritonX-100条件下处理1 h，脂肪酶被激活，蛋白酶活力基本不变；地衣芽孢杆菌脂肪酶和蛋白酶用2%(v/v)TritonX-100处理20 min后活力均保持稳定，用0.5%(v/v)正己烷、异丙醇处理1 h后，酶活力基本不变。两种微生物所产酶均能在含有表面活性剂和有机溶剂的环境中保持酶活。与之相比，本研究中发酵性丝孢酵母脂肪酶和蛋白酶用0.01%(v/v)TritonX-100处理30 min后脂肪酶和蛋白酶活力均明显激活，有利于发酵性丝孢酵母脂肪酶和蛋白酶的同时应用。20%(v/v)正己烷、异丙醇均能够明显地激活脂肪酶的活力而抑制蛋白酶活力。金属离子Ca2+、Mn2+能够激活蛋白酶但对脂肪酶不利。生产过程中为了保证脂肪酶和蛋白酶的活性，可添加7.5%(w/v)蔗糖作为酶的保护剂。若将发酵性丝孢酵母胞内脂肪酶和蛋白酶应用于洗涤剂中，需要在洗涤剂中加入水软化剂，以免水中金属离子对酶产生钝化作用。

4结论

发酵性丝孢酵母产生的脂肪酶与蛋白酶最适温度均为55 ℃，最适pH分别为6.8和7.0。浓度为5 mmol/L的金属离子Mg2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+和Cu2+分别对脂肪酶均产生抑制作用，而Ca2+和Mn2+能够激活蛋白酶。0.01%(v/v)TritonX-100、7.5%(w/v)蔗糖对脂肪酶和蛋白酶均具有激活作用。20%(v/v)甲醇、乙醇、异丙醇、正己烷、甲苯对脂肪酶均具有激活作用，其中正己烷激活作用最大；而所试有机溶剂均严重抑制蛋白酶活力。0.5%(w/v)可溶性淀粉和1%～2.5%(w/v)酪蛋白使脂肪酶活力提高，能够有效保护脂肪酶活力而不利于保护蛋白酶活力。可见，发酵性丝孢酵母胞内脂肪酶和蛋白酶均耐高温，对表面活性剂也有一定耐受能力，蛋白酶耐碱，7.5%(w/v)蔗糖可作为二者的酶保护剂，把该两种酶作为洗涤用酶具有可能性。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.004

基金项目：辽宁省科技厅2014年自然科学基金项目优秀人才培育专题(2014026013)。

作者简介：许燕博(1989～)，女，硕士研究生。E-mail：xuyanbo1031@163.com。

*通讯作者：孙玉梅(1962～)，女，教授。

Characterization of lipase and protease from Trichosporon fermentans

XU Yan-bo, WANG di, HOU Ying-min, SUN Yu-mei, WANG Ning-han

School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034

AbstractFor researching the potential application of intracellular lipase and protease from Trichosporon fermentans, the influences of temperature, pH, cations, organic solvents, surfactants, sucrose, starch and casein on activities of enzymes were studied. The intracellular enzymes were obtained by ultrasonication. The results revealed that lipase and protease showed the maximum activities at 55 ℃ and neutral pH. The lipase activity was reduced while the protease activity could be partially increased by 5 mmol/L Ca2+and Mn2+. The lipase was stimulated by 20%(v/v)methanol, ethanol, isopropanol, n-hexane and toluene, to the highest activity by n-hexane. And the protease was strongly inhibited by all the tested organic solvent. The activities of lipase and protease were increased in the presence of 0.01% (v/v) TritonX-100 and 7.5% (w/v) sucrose. It was revealed that 0.5% (w/v) amylodextrine and 1%～2.5% (w/v) casein could activate lipase but inhibit protease. These characteristics provided the potential application of the lipase and protease from Trichosporon fermentans in detergents.

Key wordsTrichosporon fermentans; lipase; protease; characteristics