产生物表面活性剂的地衣芽孢杆菌种子培养条件研究

尤　贺,　唐文竹,　孙玉梅

大连工业大学 生物工程学院,辽宁 大连 116034



产生物表面活性剂的地衣芽孢杆菌种子培养条件研究

尤贺,唐文竹,孙玉梅*

大连工业大学 生物工程学院,辽宁 大连 116034

摘要：本文对产生物表面活性剂的油藏地衣芽孢杆菌种子培养条件进行优化。通过测定种子培养液中菌体浓度和发酵液的菌浓及表面张力，研究温度、通气量、接种龄、接种量对种子生长和发酵产生物表面活性剂的影响。确定了种子适宜培养条件为装液量100 mL/250 mL，12层纱布封口，于50 ℃、180 r/min摇床培养14 h。以10%接种量接种发酵，发酵24 h的发酵液表面张力降至最低，为22.6 mN/m。在该条件下培养种子，可缩短种子培养时间，实现提前接种发酵并高产生物表面活性剂。

关键词：地衣芽孢杆菌； 生物表面活性剂； 种子培养； 表面张力

生物表面活性剂是由微生物发酵或酶催化合成的具有高表面活性的两亲性次级代谢产物[1]，具有很高的生物降解性、起泡性和选择性，在极端环境条件下仍能保持活性，且毒性和刺激性较低。因此，在环境治理、石油、食品、农药、纺织等领域得以广泛应用，在一些领域已经完全替代化学合成表面活性剂。但其应用和推广受到产量低、生产成本高等问题的限制[1,2]。

为了提高生物表面活性剂产量，目前国内外研究大多对发酵条件进行优化，对种子培养条件研究较少。微生物发酵生产的种子培养目的在于较短的时间内获得大量健壮和代谢活性强的种子，为发酵合成产物奠定基础[3]。种子培养条件对获得优良种子至关重要，不仅影响种子生物量还影响其代谢产物合成能力。产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌的种子培养优化条件为，在pH 6～8、30 ℃培养，以5%接种量接种此条件培养的种子，可使发酵鼠李糖脂产量提升至13.024 g/L[4]。对BacillussubtilisSPB1的种子培养条件、接种龄、接种量进行优化，优化后可使生物表面活性剂产量提高至3.3 g/L[5]。本文对产生物表面活性剂的地衣芽孢杆菌种子培养条件进行优化，并对发酵的接种龄和接种量进行研究，以期获得健壮种子，为微生物发酵生产提供条件。

1材料与方法

1.1菌株

菌株分离自辽河油田的原油，经16s rDNA 鉴定为BacilluslicheniformisDGG-1-3-F，菌种用20%甘油保存于-80 ℃冰箱。

1.2培养基

斜面培养基(g/L)：牛肉膏 5，蛋白胨 10，NaCl 5，琼脂 20，pH 7.0。

种子培养基(g/L)：牛肉膏 5，蛋白胨 10，NaCl 5，pH 7.0。

发酵培养基(g/L)：可溶性淀粉10，KH2PO43.4，Na2HPO41.5，NaNO34.0，MgSO4·7H2O 0.2，酵母浸粉0.2，pH 7.0。

1.3实验方法

1.3.1菌种活化与培养

取在-80 ℃保存的地衣芽孢杆菌，接一环于斜面种子培养基上，于30 ℃培养24 h，于4 ℃保存备用。取斜面菌种，接种于新的斜面种子培养基上，于30 ℃培养24 h，使其活化。取两环活化的菌种，接种于种子培养基中，于设定的温度和转速摇床培养一定时间，得种子液。在种子培养过程定期取样测定菌体密度。

1.3.2发酵条件

将种子液以10%接种量接种至发酵培养基中，在装液量20 mL/50 mL，14层纱布封口的三角瓶中于30 ℃、160 r/min的摇床发酵96 h。在发酵过程中定期取样测定菌体浓度和表面张力。

1.3.3温度和通气量对种子生长和发酵产生物表面活性剂的影响

取20环活化的菌种，用20 mL生理盐水制成均匀菌液，吸取2 mL菌液至装液量100 mL/250 mL，14层纱布封口的三角瓶中，将三角瓶分别置于30 ℃、40 ℃、50 ℃摇床中培养，摇床转速160 r/min，定期取样测定菌体浓度。分别取各培养温度下的对数生长期末期的种子，以10%接种量接种至发酵培养基中，定期取样测定发酵液菌体浓度及表面张力。通过种子生长、发酵液菌体浓度及表面张力确定适宜种子培养温度。在适宜温度基础上，按前述实验方法，将三角瓶分别置于140 r/min、160 r/min和180 r/min摇床中培养，其它条件不变，通过种子生长、发酵液菌体浓度及表面张力确定适宜种子培养摇床转速。在适宜温度、转速的基础上，按前述实验方法，将种子培养所用三角瓶分别用12、14和16层纱布封口，其它条件不变，通过种子生长、发酵液菌体浓度及表面张力确定适宜种子培养封口纱布层数。

1.3.4接种龄和接种量对发酵产生物表面活性剂的影响

在适宜条件下培养种子，分别培养至对数生长期、对数生长期末期、稳定期后分别以10%接种量接种至发酵培养基中。发酵条件同上。通过发酵液菌体浓度及表面张力，确定适宜接种龄。

将适宜条件下培养的种子培养至适宜接种龄，分别以5%、10%和15%接种量接种至发酵培养基中，通过发酵液菌体浓度及表面张力，确定适宜接种量。

1.3.5菌体浓度测定

采用浊度法[6]，于600 nm测定。

1.3.6表面张力测定

将发酵液于10 000 r/min离心20 min，得发酵上清液。在室温下，采用吊环法[7]测定发酵上清液的表面张力。

所有的培养和测定均为三个平行试验，实验结果为三个平行实验的平均值。

2结果与讨论

2.1温度对种子生长和发酵产生物表面活性剂的影响

由图1a可知，于50 ℃、40 ℃和30 ℃培养的种子分别在16 h、22 h和28 h达到对数生长期末期。取培养至该时期的种子接种发酵，结果见图1b，随种子培养温度的升高，发酵过程中菌体生长速度和发酵液表面张力下降速度加快，接种50 ℃培养的种子发酵的菌体生长最快，表面张力降低最多，发酵24 h降至最低值24 mN/m，接种30 ℃培养的种子发酵的菌体生长最慢，表面张力降低最少，发酵48 h降至最低值28.25 mN/m。说明，温度不仅影响种子生长，还影响其发酵过程中菌体生长和生物表面活性剂合成[8]。因此，取50 ℃为适宜种子培养温度。

a：种子生长；b：发酵过程中菌浓及表面张力

2.2通气量对种子生长和发酵产生物表面活性剂的影响

在三角瓶培养阶段，摇床转速和三角瓶封口的纱布层数均会影响三角瓶液体培养的通气量[9]。

由图2a可知，于180 r/min、160 r/min和140 r/min培养的种子分别在14 h、16 h和20 h达到对数生长期末期。取培养至该时期的种子接种发酵，结果见图2b，随种子培养摇床转速的升高，发酵过程中菌体生长速度加快，接种180 r/min培养的种子发酵的菌体生长最快，表面张力降低最多，发酵48 h降至最低值23.75 mN/m，接种140 r/min和160 r/min培养的种子发酵的表面张力相近，发酵72 h降至最低值26 mN/m和26.25 mN/m。因此，取180 r/min为适宜种子培养摇床转速。

a：种子生长；b：发酵过程中菌浓及表面张力

由图3a可知，于16、14和12层纱布封口的三角瓶中培养的种子都在14 h达到对数生长期末期，说明封口三角瓶的纱布层数对种子生长快慢影响不大。取培养至该时期的种子接种发酵，结果见图3b，随封口三角瓶的纱布层数的增加，发酵过程中菌体生长速度和发酵液表面张力下降速度减慢，接种12层纱布封口的三角瓶所培养的种子发酵的菌体生长最快，表面张力降低最多，发酵24 h降至最低值22.75 mN/m。接种16层纱布封口的三角瓶所培养的种子发酵的菌体生长最慢，表面张力降低最少，发酵24 h降至最低值26.65 mN/m。因此，取12层为适宜种子培养封口纱布层数。由以上结果可知，通气量不仅影响种子生长，还影响其发酵过程中菌体生长和生物表面活性剂合成，且通气量多利于生物表面活性剂的合成[9]。在本实验范围内，摇床转速比纱布层数对种子生长的影响要大，但二者对发酵的影响差异不大。

a：种子生长；b：发酵过程中菌浓及表面张力

2.3接种龄对发酵产生物表面活性剂的影响

由图4可知，接种培养14 h的种子发酵的菌体生长最快，表面张力降低最多，发酵24 h降至最低值22.7 mN/m。一般接种的种子培养时间以对数生长期末期即培养液中菌浓接近高峰时所需的时间较为适宜。 培养时间较短的种子接种后往往会出现前期生长缓慢，整个发酵周期延长，产物开始形成时间推迟。培养时间较长的种子虽然菌量较多但接种后会导致生产能力的下降，菌体过早衰退[3]。因此，取14 h为适宜接种龄，这与彭新榜等人研究结果相同[10]。

图4　接种龄对发酵生产的影响

2.4接种量对发酵产生物表面活性剂的影响

由图5可知，接种量为10%时，发酵的菌体生长最快，表面张力降低最多，发酵24 h降至最低值22.6 mN/m。其次是接种量15%。接种量为5%时，发酵初期菌浓低，发酵液表面张力下降慢，第72 h时菌浓接近其它两个接种量，表面张力降至最低的值也与其接近，说明接种量小只会推迟达到最大菌体量和表面张力降至最低值的时间。因此，取10%为适宜接种量，这与解舒涵等人研究结果相同[11]。

图5　接种量对发酵生产的影响

3结论

本试验对地衣芽孢杆菌种子培养条件进行优化，确定了种子适宜培养条件为装液量100 mL/250 mL，12层纱布封口，于50 ℃、180 r/min摇床培养14 h。以10%接种量接种发酵，发酵24 h的发酵液表面张力降至最低，为22.6 mN/m。试验发现，种子培养温度对种子生长和发酵产生物表面活性剂的影响较大。本研究为缩短种子培养和发酵时间，提高BacilluslicheniformisDGG-1-3-F产生物表面活性剂产量奠定了一定的基础。

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[11]解舒涵, 何连芳, 张玉苍. 产生物表面活性剂芽孢杆菌培养条件的优化[J]. 生物技术通报, 2012, 4:127-134.

doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.006

作者简介：尤贺(1992～)，男，硕士研究生。 E-mail:716863212@qq.com。

*通讯作者：孙玉梅(1962～)，女，教授。

Cultivation conditions of inocula for Bacillus licheniformis producing biosurfactant

YOU He， TANG Wen-zhu， SUN Yu-mei

College of Biology Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China

AbstractBacillus licheniformis isolated from crude oil was used to produce biosurfactant. The cultivation condition of inocula was optimized in this research. By measuring the cell density in inoculum culture broth, the cell density and surface tension in fermenting broth, the effects of temperature, ventilation and time of inoculum cultivation and inoculation rate on cell growth and the surfactant production in fermentation were investigated. The results indicated that the inocula should be cultivated at 50 ℃, 180 r/min for 14 h in 100 mL/250 mL shaking flasks sealed with 12-layer gauze. And when the fermentation was conducted for 24 h with 10% of inoculation rate, the surface tension of cell-free fermenting broth lowered to the minimum 22.6 mN/m. Inocula cultivation under the optimal conditions could shorten the cultivation time of inocula and result in earlier biosurfactant production and higher yield in the fermentation.

Key wordsBacillus licheniformis; biosurfactant; inocula cultivation; surface tension

项目名称：大连市科技局 (编号：2013B11NC078)。