多重PCR-DHPLC快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌

晚观生，　刘晓玉，　郑秋月，　徐君怡，　曹际娟*

1.大连工业大学，辽宁大连 116034；2.辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连 116001



多重PCR-DHPLC快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌

晚观生1，刘晓玉1，郑秋月2，徐君怡2，曹际娟2*

1.大连工业大学，辽宁大连 116034；2.辽宁出入境检验检疫局，辽宁大连 116001

摘要：应用多重PCR(motiplex PCR)结合变性高效液相色谱技术(denaturing high-performance liquid chromatography, DHPLC)建立了快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌O111和O157的方法。以基因wzxO111、rfbEO157为靶基因，建立多重PCR-DHPLC方法，进行特异性和灵敏度测试，同时进行RT-PCR检测比较灵敏度。该方法具有良好特异性，可以一次PCR扩增同时检测O111、O157；灵敏度达到25 CFU/mL。129份牛肉样品中检出1例O111，3例O157阳性；74份鸡肉样品中检测出O111、O157阳性各1例，67份蔬菜样品中未检测到O111、O157。本文建立O111、O157多重PCR-DHPLC检测方法，操作简便，特异性强，适用于产志贺毒素大肠杆菌筛选检测。

关键词：多聚酶链式反应； 变性高效液相色谱； 检测； 产志贺毒素大肠杆菌

产志贺毒素大肠杆菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli,STEC)是一类危害严重的食源性病原菌，能引起人类严重疾病，如出血性结肠炎(HC)、溶血性尿毒症(HUS)等，甚至引起死亡,已成为威胁人类健康的重要公共卫生问题[1-2]。根据血清型的不同可将STEC分为O157STEC和非O157STEC。除了致病型O157型STEC外，非O157型STEC中O111菌株近年来成为高致病力菌株，对人类的健康也存在严重威胁。人类通过食用被污染的食物和饮水而感染此类病原菌[3-4]。

目前，产志贺毒素大肠杆菌鉴定仍主要依靠传统培养鉴定和血清学方法[5-6]。由于产STEC种属之间或与其他大肠杆菌生化反应极为相似，难于分离，不同的“O”血清型之间还存在交叉反应，导致菌株无法准确鉴定。而且进口血清价格昂贵，国产血清效价不稳定，传统培养鉴定方法检测周期长，已无法满足当今食品安全快速发展的需求[7]。DHPLC方法可以稳定准确从种属菌株水平鉴别微生物, 弥补传统生化鉴定方法的缺陷。本文通过非变性条件下，优化多重PCR反应条件及DHPLC洗脱梯度，建立了多重PCR-DHPLC快速检测O111、O157的方法。具有快速、准确度高、重复性好及敏感性高等特点[11-14]。

1材料

1.1菌种

产志贺毒素大肠杆菌O157购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)；产志贺毒素大肠杆菌购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)，其他菌株分别购自ATCC和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)，或为本实验室或其他检验检疫局实验室分离鉴定获得的分离株。

1.2主要培养基

改良蛋白胨大豆肉汤(TSB+1.5 g/L胆盐三号mTSB)；普通营养肉汤；营养琼脂斜面；科玛嘉O157显色培养基；3M大肠杆菌/大肠菌群快速检测纸片；O111特异诊断血清(宁波天润生物药业有限公司)；O157特异诊断血清(丹麦国立血清研究所)。

1.3主要试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒(TakaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit)，Multiplex PCR Assay Kit Ver.2等试剂购自宝生物(大连)工程有限公司。三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司；DHPLC缓冲液：缓冲溶液A为50 mL TEAA、250 μL乙腈定容至1 000 mL；缓冲溶液B为50 mL TEAA、250 mL乙腈定容至1 000 mL；缓冲溶液D为75%乙腈[15]。

表1　试验菌种及其编号

1.4引物和探针

实时荧光PCR特异引物序列及探针由宝生物(大连)工程有限公司设计合成， 见表2。多重PCR中wzxO111、rfbEO157引物分别引用文献16、17，由宝生物(大连)工程有限公司合成(见表3)。

表2　荧光定量PCR引物及探针信息

注：(—)表示无需标记

1.5仪器设备

普通PCR 仪PE24000(PerkinElmer公司，美国)；变性高效液相色谱仪NAV-99-4500(Transgenomic 公司，美国)； Vii7数字荧光定量PCR(美国ABI仪器公司)； VITEK2-30全自动微生物鉴定仪(法国生物梅里埃公司)。

表3　普通PCR引物信息

2试验方法

2.1DNA模板提取

取表1中20株所试菌株进行普通肉汤增菌培养。提取细菌基因组DNA, -20 ℃保存备用。

2.2RT-PCR反应体系及扩增条件

经过多次试验比对建立最适反应体系:PremixExTaq(Probe qPCR)(2×)12.5 μL；ROX Reference Dye II(50×)0.5 μL；上下游引物(10 μM)各0.5 μL；TaqMan Probe 1 μL； DNA模板2 μL；水8 μL，总体系25 μL。扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s；56 ℃退火(延伸)34 s；进行40个循环。

2.3多重PCR反应体系及扩增条件

多重PCR反应体系：2×Multiplex PCR Buffer(Mg2+, dNTP plus)25 μL；Multiplex PCR Enzyme Mix 0.25 μL；各引物对1 μL；模板DNA 2 μL；加水补足50 μL体系。扩增反应条件：94 ℃ 60 s；94 ℃变性30 s；57 ℃退火45 s；72 ℃延伸30 s，进行35个循环，72 ℃ 10 min。4 ℃保存反应产物。

2.4DHPLC分析条件

色谱柱:PS-DVB& C18 DNASep色谱柱(4.6 mm×50 mm, 粒度3 μm)；柱温：50 ℃。流动相：0 min，55 % 缓冲溶液A，45%缓冲溶液B；0.5 min，50.2%缓冲溶液A，49.8%缓冲溶液B；3.6 min，41.8%缓冲溶液A，58.2%缓冲溶液B；6.8 min，38.2%缓冲溶液A，61.8% 缓冲溶液B；9.9 min，36.3%缓冲溶液A，63.7%缓冲溶液B；13 min，35%缓冲溶液A，65%缓冲溶液B；流速：0.9 mL/min。上样量：PCR产物5 μL[18-19]。

2.5特异性试验

取表1中20株细菌建立DNA模板库, 进行RT-PCR特异性检测，同时采用2.4中DHPLC方法进行验证。

2.6灵敏度试验

各取1 mL标准菌株O111、O157增菌液，梯度稀释，取10-6、10-7两个梯度1 mL进行平板涂布，每个梯度两个平行，采用GB4789.2-2010进行菌落计数[20]。分别采用RT-PCR和多重PCR-DHPLC方法进行灵敏度检测。

2.7实际样品检测

最后随机抽取送检至辽宁出入境检验检疫局实验室的129份冷冻牛肉、74份鸡肉、67份蔬菜样品，采用本文建立的RT-PCR和多重PCR-DHPLC方法进行实际样品检测。

3结果分析

3.1特异性试验

RT-PCR特异性试验中只有O111、O157目标菌株出现特异性阳性扩增如图1、图2，其他参考菌株检测结果均为阴性。多重PCR-DHPLC检测结果如图3所示，结果表明O111具有特异性吸收峰，O157特异性吸收峰明显，其他对照菌株均未出现明显的吸收峰，表明本文的引物特异性良好。

图1　O111 RT-PCR特异性扩增结果

图2　O157 RT-PCR特异性扩增结果

A. O111(ATCC 43887)特异吸收峰； B. O157(CICC 21530)特异吸收峰

C. O111(ATCC 43887)特异吸收峰；

D. O157(CICC 21530)特异吸收峰

3.2灵敏度试验

结果如表4所示，结果表明本文建立的多重PCR-DHPLC方法与RT-PCR方法，最低检测限均达到2.5×101CFU/mL。

表4　mPCR-DHPLC与RT-PCR灵敏度检测结果

+：代表阳性-：代表阴性

3.3实际样品检测

本文建立的多重PCR-DHPLC方法与RT-PCR方法检测129份样品，牛肉样品中检出1份O111阳性、3份O157阳性；74份鸡肉中检出1份O157阳性，未检测到O111，67份蔬菜中未检测到O111及O157如表5。

4讨论

本文建立了多重PCR结合DHPLC准确快速检测食品中产志贺毒素大肠杆菌O111、O157。通过多次试验发现，影响多重PCR结果主要是PCR反应的退火温度及延伸时间，同时引物对的浓度也直接影响方法的特异性和灵敏度。通过与RT-PCR灵敏度比较发现，该方法不仅保证与RT-PCR具有相同的灵敏度，还可以实现高通量检测，而且省去了探针设计的过程，避免了由探针问题造成假阳性或假阴性的结果，操作过程简单，自动化可更好的适用于食品检测。本文从实际样品中分离出来的产志贺毒素大肠杆菌阳性菌株，通过血清型鉴定，均证实为产志贺毒素大肠杆菌，证明多重PCR-DHPLC检测方法具有广泛的适用性。

表5　mPCR-DHPLC与RT-PCR检测结果比较

在食品中产志贺毒素大肠杆菌常为低污染量存在，常规直接分离法存在着鉴别力差、抑制杂菌能力弱、耗时长、工作量大等缺点 影响了该菌的检出率，达不到相关食品检验监管部门检测要求。开展不同食品基质中目标菌分离方法研究，采用免疫磁珠技术富集分离食品中低污染量产志贺毒素大肠杆菌，是本文下一步研究方向。本文将在现有成果基础上进行样品中目标菌富集方法研究，解决不同基质对菌体活性干扰、降解因素难题，开展纳米磁珠高效富集分离低污染量产志贺毒素大肠杆菌的方法，解决目标菌检出率低的难题。建立纳米磁珠高效富集结合多重PCR-DHPLC检测方法，进一步提高食品中产志贺毒素大肠杆菌的检测效率。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.008

基金项目：质检总局课题(2015IK168)；质检公益性行业科研专项(201210043)。

作者简介：晚观生(1990～)，男，硕士研究生，主要研究方向为食品安全与检验检疫。E-mail:wanguansheng@126.com。 *通讯作者：曹际娟，女，博士，研究员，主要研究方向为食品安全与检验检疫。E-mail:caojijuanlnciq@163.com。

Rapid detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli by multiplex PCR and DHPLC

WAN Guan-sheng1, LIU Xiao-yu1, ZHENG Qiu-yue2, XU Jun-yi2, CAO Ji-juan2

1. Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau of China, Dalian 1160001, China

AbstractThe method of multiplex PCR combined with denaturing high-performance liquid chromatography was established for rapid detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli O111 and O157 in food. The multiplex PCR assay for detecting Shiga toxin-producing Escherichia coli O111 and O157 was developed using primers with specifically amplifing segments of wzxO111 and rfbEO157 genes. The method was carried out for specificity and sensitivity testing and its sensitivity was compared with RT-PCR method at the same time. Results indicated that the multiplex PCR-DHPLC had good specificity; a PCR amplification could detect both O111 and O157 simultaneously. The detection limit of the mPCR was 25 CFU/mL for sensitivity. One of O111 and three of O157 were detected in 129 beef meat samples. In 74 chicken meat samples contained one of O111 and one of O157. Shiga toxin-producing Escherichia coli O111 and O157 were not detected in 67 vegetables. As a result, the multiplex PCR-DHPLC detection method for O111, O157 was simple, specific and suitable for Shiga toxin Escherichia coli screening test.

Key wordsmultiplex polymerase chain reaction (mPCR); denaturing high-performance liquid chromatography (DHPLC); detection; Shiga toxin-producing Escherichia coli