乙醇耐受性酿酒酵母菌株选育的研究进展

尤　亮，　丁东栋，　崔志峰

浙江工业大学生物工程学院， 浙江杭州 310032



乙醇耐受性酿酒酵母菌株选育的研究进展

尤亮，丁东栋，崔志峰*

浙江工业大学生物工程学院， 浙江杭州 310032

摘要：酿酒酵母是工业发酵生产乙醇的重要菌种，但是其发酵产物乙醇对酿酒酵母有明显的抑制作用。选育乙醇耐受性酿酒酵母是克服高浓度乙醇的抑制作用，提高乙醇产量的一条重要途径。本文对近年来国内外选育乙醇耐受性酵母的研究作一综述，旨在为乙醇耐受性酵母的选育提供参考。

关键词：酿酒酵母； 乙醇发酵； 耐受性； 菌株选育

随着环境污染的加剧和全球石油能源的日渐枯竭，开发新的清洁能源势不容缓，生物乙醇作为一种新型的可再生能源，日益成为研究热点。酿酒酵母以其特有的生理特征以及发酵性能成为人们广泛选用的乙醇生产菌[1]。目前提高酿酒酵母乙醇产量的方法主要有两个：一是乙醇发酵工艺的优化，如高密度发酵(VHG) ；二是选育乙醇高耐受性和发酵性能优良的菌株。

乙醇发酵过程中，酿酒酵母往往会受到各种胁迫因素：包括发酵过程中的温度、渗透压、以及终产物乙醇浓度的影响，其中终产物乙醇对菌株毒性作用是制约酿酒酵母生产乙醇的一大瓶颈[2]。迄今为止应用自然选育、诱变育种、基因工程和基因组重排等技术选育乙醇耐受性酵母菌株是克服此瓶颈的重要途径之一。本文对近年来国内外选育乙醇耐受性高产酵母菌株的研究做一综述。

1自然选育

自然选育是从自然界存在的自发突变体中筛选具有优良特性的菌株。该方法简单实用，目前仍是筛选高乙醇耐受性酵母菌株的有效方法之一。如赖颖等[3]以宋河酒厂窖泥、酒槽、酒厂废水为样品，用含16%和18%乙醇浓度的平板初筛，2,3,5-氯化苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)显色平板复筛和酒精发酵试验验证，最终得到1株耐乙醇浓度为18%的酵母菌株A16。在葡萄糖25%，酵母膏2%，蛋白胨1%的培养基，菌株A16 的酒精得率为70 %。吴华昌等[4]从泸州老窖的白酒窖槽中分离乙醇耐受性高的酵母菌株，经8%乙醇浓度平板初筛，TTC显色平板复筛，最终用酒精发酵试验验证得到酵母菌株A2。酵母菌株A2可耐18%乙醇浓度，在优化的葡萄糖浓度为20%的发酵培养基，温度34 ℃、pH为4.5，发酵72 h后，发酵液中乙醇浓度达到9.5%。费文斌等[5]以江苏省灌南县汤沟酿酒厂的大曲、窖泥及发酵酒醅为样品，经过TTC固体平板的一级筛选和杜氏小管产气观察的二级筛选，最终通过发酵试验得到一株乙醇耐受性酵母菌，命名为NR11。NR11在12%乙醇浓度及55%葡萄糖浓度下可正常发酵，而且致死温度可达60 ℃。在30 ℃、38 ℃、40 ℃和42 ℃，初始葡萄糖浓度为260 g/L条件下，乙醇产量分别可以达到109.0g/L、93.2 g/L、73.8 g/L和44.0 g/L。NR11是一株有潜在的工业生产应用价值的酵母菌株，具有广阔的应用前景。

上述自然选育大都选择了酒厂窖泥、酒槽或酒厂废水等为样品，并且都筛选得到了可耐18%乙醇浓度浓度的酵母菌株。这表明长期的较高乙醇浓度的酒厂周边环境非常有利于耐乙醇自然突变酵母菌株的积累，从这些环境样品出发自然选育耐乙醇酵母菌株仍是行之有效的好方法。

2诱变育种

诱变育种是利用物理和化学的方法处理供试菌株，提高其突变频率，并通过定向筛选获得具有某种优良特性的菌株。易戈等[6]以酿酒酵母JL2008为出发菌株，在10 W的紫外灯下进行紫外照射诱变40 s，经酒精浓度为8%的固体培养基上初筛和TTC法复筛，最终筛选得到突变菌株SC1。在30%葡萄糖浓度下发酵乙醇，64 h后突变菌株SC1的酒精浓度达到16.54%，比出发菌株高11.6%，是一株非常有潜力的应用于浓醪发酵的酵母菌株。Dong等[7]以酿酒酵母ATCC 76740为出发菌株，经过硫酸二乙酯(Diethyl sulfate，DES)处理和耐乙醇、糠醛浓度的筛选，最终得到乙醇耐受性突变菌株4D-6。突变菌株4D-6在37 ℃、29 g/L葡萄糖浓度下发酵乙醇的产量达到11.2 g/L，是野生型的3.6倍。

李杨等[8]以耐酸性酵母A3为出发菌株，对其原生质体进行紫外线(UV)与亚硝基胍(Nitrosoguanidine，NTG)复合诱变，筛选出一株乙醇高耐受性、高产的酵母菌株UN1-81。30 ℃，pH 4.0酸性条件下，发酵72 h后测得UN1-81菌株的残糖量和酒精浓度分别为5.76 mg/mL和11.17%vol(v/v)，比出发菌株提高了16.47%。Zhang等[9]利用高能电子束(high-energy pulse electron beam，HEPE)和原生质体融合诱变酿酒酵母YZ1，筛选出一株乙醇耐受性、耐热性突变菌株YF31，可于42 ℃高温条件下生产乙醇。突变菌株YF31在34 ℃、20%葡萄糖条件下发酵乙醇的产量为139.3 g/L相比出发菌株YZ1提高了40%；在42 ℃、20%葡萄糖条件下发酵乙醇的产量为(94.2±4.8) g/L，相比出发菌株YZ1提高了2.48倍。

诱变育种方法是选育乙醇耐受性酵母菌株的常用技术，该方法简单易行可提高突变频率，而且对仪器设备要求不高。诱变育种不仅能有效获得乙醇耐受性菌株，而且还有很大的概率能同时获得耐高糖、耐酸性或耐高温等性能。

3基因工程育种

酵母菌的乙醇耐受性是受多基因控制的，Yoshikawa等[10]鉴定了酿酒酵母在乙醇压力下的基因表型，发现有359个基因与乙醇耐受性有关。影响酵母乙醇耐受性的重要因子之一是胞内海藻糖浓度，Cao等[11]将扣囊复膜孢酵母的海藻糖合成基因TPS1与载体pMIRSC11连接后导入酿酒酵母Saccharomycessp.W0中表达，筛选得到菌株Z8。在18%(v/v)乙醇浓度下，3 h后Z8存活率为25.14%，而出发菌株W0存活率仅为12.09%。在30 ℃、200 g/L葡萄糖、10 g/L硫酸铵条件下发酵乙醇，Z8的乙醇产量达到16.4%(v/v)，相比出发菌株W0乙醇产量提高了15.5%。张晓阳等[12]以工业酿酒酵母菌株Zd4的两株优良单倍体Z1和Z2为出发菌株，分别进行3种基因操作：(1) 通过强启动子PGK1过表达TPS1 ，(2) 敲除海藻糖水解酶基因ATH1 ，(3)同时过表达TPS1和敲除ATH1。经此三种基因工程操作后再将每组的工程菌杂交获得了三株代谢工程菌株Z12ptps1、Z12Δath1、Z12pTΔA，在270 g/L葡萄糖浓度下乙醇产量分别为122.37 g/L、121.24 g/L、124.82 g/L，与原始出发菌株Zd4的116.71 g/L分别提高4.9%、3.9%、7.0%。Yang等[13]研究在酿酒酵母中过表达ATP结合外排蛋白提高乙醇耐受性，他们将编码假定的多耐药性外排蛋白基因ADP1扩增后与pYES2载体连接，然后转入酿酒酵母BY4741中获得工程菌iETS3，可在半乳糖诱导下过表达ADP1。在添加5%乙醇浓度压力下，20 g/L半乳糖发酵28 h后乙醇产量增加了5 g，比对照菌株提高了20%。

上述基因工程育种通常是通过敲除或过表达与乙醇耐受性有关的基因，如过表达TPS1基因提高酵母的乙醇耐受性。与诱变育种相比，基因工程具有很明确的靶标位点。但是，酿酒酵母的乙醇耐受性是受多基因控制的，仅改变单个基因的效果有一定的局限性。通过全局转录方法提高酿酒酵母乙醇耐受性成为一种颇有前景的策略。

4全局转录工程

Alper等[14]发现酿酒酵母RNA聚合酶Ⅱ转录复合体TFⅡD成分SPT15基因中3个氨基酸的突变可以大幅提高酿酒酵母对乙醇的耐受性，并首次提出了全局转录工程(Global transcriptional machinery engineering，gTME)，为提高酿酒酵母对乙醇的耐受性提供了新的思路。Liu等[15]采用全局转录工程的方法，先用易错PCR获得SPT15基因突变体，与pYX212载体连接后，再转化酿酒酵母YPH499，选出乙醇耐受性高并能利用木糖的酵母菌株spt15-29。在含68.41 g/L木糖和7.67 g/L葡萄糖培养基中发酵，71 h后突变菌株spt15-29对木糖和葡萄糖的利用率分别为65.7%和87.0%，乙醇的浓度为11.9 g/L，相比出发菌株提高了4倍。Yang等[16]以pT-spt15作为模板使用PCR随机突变试剂盒使spt15基因发生突变，与pRS316- GCYH2gR载体连接，再转化酿酒酵母菌株L3262。用YSCD-Ura固体缺陷平板初筛，乙醇浓度为12.5%(v/v)和15%(v/v)的固体平板复筛，最终得到表型最好的两株突变株iETS2和iETS3。在30 ℃、500 mL YPD培养基发酵乙醇，24 h后葡萄糖几乎被消耗完，突变酵母菌株iETS2、iETS3发酵乙醇的最终浓度都达到了77 g/L，比原始菌株提高了25.2%。赵清心等[17]研究了另一个转录因子SPT3的突变对酿酒酵母乙醇耐受性的影响，他们将易错PCR获得的SPT3基因突变体与载体pYES2.0连接，转入酿酒酵母S.cerevisiae4126中，成功筛选出一株在10%(v/v)乙醇中生长较好的突变菌株M25。在125 g/L葡萄糖浓度下，突变株M25的乙醇产量为53.6 g/L，比对照株提高了11.7%。

Yu等[18]将SPT3和SPT15与载体pGupCas连接，用GAL10启动子过表达SPT3和SPT15，并转化酿酒酵母YPH499，得到重组菌株YPH499(pGupSpt3.15Cas)，用含0.02%半乳糖和2%甘油的SG-甘油培养基发酵，96 h乙醇的浓度为8.1 g/L，相比对照菌株提高了1.8倍。

全局转录工程是通过改造全局转录调控因子来获得具有某种优良性状的菌株，对于选育乙醇耐受性菌株这种受多基因控制的突变体，全局转录工程是一种有效的方法。

5基因组重排育种

基因组重排是通过多亲本之间的DNA重组和全基因组片段交换，将各亲本优良性状重组在一起。Wang等[19]以酿酒酵母Y12出发得到Y1和Y2单倍体菌株，先分别进行紫外照射和甲基磺酸乙酯突变操作，用含乙醇浓度为10%的YNB平板初筛并收集耐乙醇突变株。突变株交配进行融合重组后再通过两次融合重组并分别经12%和14%乙醇浓度的YNB平板复筛，最终得到表型最好的融合子TS5。在葡萄糖浓度为285 g/L下发酵，乙醇浓度达到127.54 g/L，相比酿酒酵母Y12提高了约7.6%。Zheng等[20]以酿酒酵母ZTW1为出发菌株，先用50 μg/L的甲基苯并咪唑-2-基-氨基甲酸叔丁酯(benzimidazole-2-yl-carbamate，MBC)处理，然后在孢子形成培养基上(1%NaAc,0.2%酵母提取物,0.1%葡萄糖,0.2%KCl,pH 6.0)收集孢子并随机杂交，用50 g/L乙醇浓度的起始筛选培养基初筛，收集其中乙醇产量最高的三株菌的孢子后再进行两次孢子交配，最后筛选出了9株乙醇耐受性和产量都很高的酿酒酵母菌株，其中S3-110菌株的乙醇产量最高。在285 g/L葡萄浓度下发酵75 h后的乙醇浓度为130 g/L，相比出发酵母ZTW1提高了11%。另外，Snoek等[21]从318株不同的酿酒酵母中选育出8株异源的酿酒酵母菌株作为亲本菌株，以孢子交配的方式经行了三循环基因组重组，经5%和12%乙醇浓度的筛选平板进行初筛，18%和22%乙醇浓度的筛选平板复筛，最后得到酿酒酵母菌株融合子H1，在32%(w/v)葡萄糖浓度下发酵乙醇浓度为18.7%(v/v)，乙醇产率为0.45 g/g。

基因组重排技术是对整个微生物全基因组进行重排的定向育种技术，它将通过诱变改良的突变菌株进行杂交育种，经过递推式的多次融合使不同的正向突变整合到一个重组子中[22]。因此，利用基因组重排技术更容易获得高乙醇耐受性，而且更适用于实际的高密度发酵工艺生产乙醇的酵母菌株。

6小结与展望

酿酒酵母产乙醇的研究经久不衰，自上世纪爆发石油危机以来，燃料短缺及环境恶化问题日趋严重，使得作为清洁能源的生物乙醇受到密切关注。酿酒酵母目前依然是生产乙醇的主要菌株，经过长达40多年的育种研究，不同的育种技术在其发展的各个时期都发挥了非常重要的作用。自然选育和诱变育种简单易行，对仪器设备的要求不高，是选育乙醇耐受性酵母不可或缺的手段。基因工程育种具有靶标明确的优点，克服了传统育种中存在的盲目性，但是由于乙醇的耐受性机制很复杂，几百种基因参与其中，使其存在自身的局限性。全局转录工程通过改造全局转录调控因子达到对多基因控制的性状进行有效的改造，改变了单个基因操作的局限性，使其成为当前研究的热点之一。基因组重排育种使酵母基因组在较大范围内发生交换和重排，与传统诱变育种结合能明显提高获得乙醇高产酵母的机会，极大的提高了酵母育种的效率。

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doi:10.3969 /j.issn.1001-6678.2016.03.010

作者简介：尤亮(1991～)，男，硕士研究生。E-mail:youliang_0501@163.com。 *通讯作者: 崔志峰，Tel:86-571-88320741，E-mail:zfcui@zjut.edu.cn。

Research progress in breeding of ethanol tolerance strain fromSaccharomycescerevisiae

YOU liang, DING Dong-dong, CUI Zhi-feng

College of Biological Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China

AbstractSaccharomyces cerevisiae is one of the important strains for ethanol production by industrial fermentation, but its product ethanol has obvious inhibitory effect on producer. Breeding of the ethanol tolerance strain from S. cerevisiae is an important way to overcome the inhibition and increase the ethanol production. In this paper, researches on breeding of ethanol tolerance strains from S. cerevisiae in recent years were outlined. It would provide reference for the breeding of ethanol tolerance strains from S. cerevisiae.

Key wordsSaccharomyces cerevisiae; ethanol fermentation; tolerance; breeding