双组份转运系统BrnFE的过表达和表面活性剂的添加对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸的影响

李忠财，　董会娜，　丛丽娜，　张大伟*

1. 大连工业大学生物工程学院， 大连 116034；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所， 天津 300308



双组份转运系统BrnFE的过表达和表面活性剂的添加对谷氨酸棒杆菌发酵生产L-异亮氨酸的影响

李忠财1,2，董会娜2，丛丽娜1*，张大伟2*

1. 大连工业大学生物工程学院， 大连 116034；2. 中国科学院天津工业生物技术研究所， 天津 300308

为了提高L-异亮氨酸生产菌株CorynebacteriumglutamicumLD320的产酸水平，通过改善其分泌系统，在C.glutamicumLD320中分别过表达突变型和野生型的双组份转运系统BrnFE操纵子，构建了重组菌LD320/pXMJ19-brnFE和LD320/pXMJ19-brnFE1。通过对两株重组菌的L-异亮氨酸生产分析比较，发现突变型比野生型能更有效地提高L-异亮氨酸产量。同时对LD320/pXMJ19-brnFE1进行表面活性剂添加实验，发现Tween-80为最佳选择，其最佳添加量为0.5 g/L，最佳添加时间为对数期的16 h。最后通过7 L发酵罐放大实验，LD320/pXMJ19-brnFE1的L-异亮氨酸产量由18.53 g/L提高到25.45 g/L，比对照组提高了37%。

双组份转运系统BrnFE； 表面活性剂； 谷氨酸棒杆菌； L-异亮氨酸

L-异亮氨酸(L-isoleucine，ILE)又称“异白氨酸”，是八种必需的氨基酸之一[1]，是人体激素、蛋白质合成和能量生成的原料[2, 3]，被广泛应用在食品添加剂、药物和动物饲料等方面[4]。目前，谷氨酸棒杆菌及棒杆菌属中的相关微生物已广泛应用于包括L-异亮氨酸在内的多种氨基酸生产中[5-7]。在谷氨酸棒杆菌代谢合成L-异亮氨酸过程中，当胞内L-异亮氨酸积累到一定量时，就会反馈抑制其合成途径的一些关键酶，从而抑制L-异亮氨酸的合成[8]。因此，对于谷氨酸棒杆菌产L-异亮氨酸的发酵来说，如何提高细胞对L-异亮氨酸的外排，对进一步提高L-异亮氨酸的产量具有重要的意义。

BrnFE是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)中负责支链氨基酸L-异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸转运运输的双组份转运载体[9]，由brnFE基因编码。当谷氨酸棒杆菌胞内的支链氨基酸量积累到一定程度时，便会激活brnFE操纵子表达[10]，使L-异亮氨酸等氨基酸外排到胞外。通过过表达brnFE基因，可以减少L-异亮氨酸在谷氨酸棒杆菌胞内的积累，削弱L-异亮氨酸在胞内对合成途径中关键酶的反馈抑制作用，从而增加其产量[11]。

同时利用表面活性剂也可以改善细胞膜通透性，在微生物发酵中经常被用来提高目标产物的产量[12]。它可加快物质传递运输，增加胞内胞外的物质平衡，从而提高了细菌对底物、产物的耐受度，解决发酵产物、副产物对微生物细胞生长和酶活性的抑制[13-15]。

本文通过在L-异亮氨酸生产菌株C.glutamciumLD320中过量表达突变型brnFE1基因，增强了胞内L-异亮氨酸到胞外的外排，使其产量增加。同时选择添加表面活性剂作进一步细胞通透性的改善，并对其添加量和添加时间进行了优化，最后在7 L发酵罐上进行了放大实验。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株和质粒

文中所用菌株与质粒均列于表1中，所用引物均列于表2中。

表1　菌株与质粒

表2　引物

1.1.2酶和试剂

试剂：限制性内切酶BamHI和EcoRI购自Thermo Fisher Scientific公司，DNA聚合酶PrimerSTAR Mix购自Takara，2xTaq PCR MasterMix， DNA Marker (Marker III和1 kb Marker)和细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302-02)购于北京天根生化科技有限公司，质粒小提试剂盒(D6943-02)和柱式PCR产物纯化试剂盒(D6492-02)购自OMEGA，L-异亮氨酸标准品为Sigma公司提供，其余试剂均为进口或国产分析纯级。

仪器：HPX-9162MBE电热恒温培养箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；Agilent Technologies 1 200高效液相色谱，Agilent Technologies；PTC-1148型PCR仪，美国BIO-RAD公司；V-1 600可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；SBA-40E生物传感仪，山东省科学院生物研究所。

1.1.3培养基

固体培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5，琼脂粉20，pH 7.0。121 ℃灭菌20 min。

种子培养基(g/L)：葡萄糖40.0，(NH4)2SO42.0，KH2PO4·3H2O 1.0，MgSO4·7H2O 0.6，FeSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.01，初始pH 7.0。115 ℃灭菌30 min。

发酵培养基(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉3，(NH4)2SO410.0，FeSO4·7H2O 0.05，MgSO4·7H2O 0.6，MnSO4·H2O 0.015，KH2PO4·3H2O 1.0，VB10.004，VH 0.000 5, 初始pH 7.0。115 ℃灭菌30 min。

可根据需要，在各培养基中分别添加相应抗生素：氯霉素，20 μg/mL。

1.2实验方法及测定

1.2.1培养方法

(1) 斜面活化培养：从-80 ℃冰箱取出保藏菌种划线于固体培养基，30 ℃培养12 h ～18 h。

(2) 种子培养：用接种环从新鲜活化斜面上挑取2环谷氨酸棒杆菌于种子基本培养基中(500 mL三角瓶，装液量为25 mL，9层纱布封口)，30 ℃，220 r/min振荡培养12 h，OD600约为1.5～1.8。

(3) 摇瓶分批发酵培养：将种子培养液按10%的接种量接入发酵基本培养基中(500 mL三角瓶，装液量为25 mL，9层纱布封口)，30 ℃，220 r/min振荡培养进行L-异亮氨酸分批发酵，pH由CaCO3调节。

1.2.2pXMJ19-brnFE和pXMJ19-brnFE1表达载体的构建

分别以C.glutamicumATCC13032和C.glutamicumLD320染色体DNA为模板，使用带有BamHI酶切位点的brnFE-F和带有EcoRI酶切位点的brnFE-R为引物PCR扩增出L-异亮氨酸输出蛋白基因brnFE和brnFE1。使用限制性内切酶BamHI和EcoRI分别对PCR产物及质粒pXMJ19进行双酶切，连接产物化学转化法转入DH5α，在终浓度为20 μg/mL氯霉素的LB平板上37 ℃培养,用引物YZ-F和YZ-R鉴定长出的转化子，挑选阳性克隆，测序。

1.2.3感受态细胞的制备及转化

质粒转化谷氨酸棒杆菌采用电转化法，C.glutamicumLD320 感受态的制备及转化方法参照余秉琦等[16]和van der Rest ME等[17]的方法。

1.2.4表面活性剂的添加对L-异亮氨酸发酵的影响

精确称取各种表面活性剂，分别配置80 g/L的母液，按照实验的不同要求，在无菌条件下，吸取相应的表面活性剂母液，添加到发酵液中。继续培养直至培养结束。探讨其对L-异亮氨酸发酵产量的影响，并进一步优化其添加量和添加时间。

1.2.5菌体生长测定

发酵液用蒸馏水稀释适当倍数，测定600 nm波长下的OD值，使其数值在0.2～0.8之间。菌体干重表示为OD×稀释倍数×0.3 g (DCW)/L。

1.2.6残糖浓度测定

采用SBA-40E生物传感仪测定。取发酵液1 mL离心，取上清液10 μL，稀释100倍后，取25 μL稀释液进样直接读数。

1.2.7氨基酸含量的测定[18, 19]

L-异亮氨酸含量采用高效液相分析系统测定，色谱分离条件：Agilent C18(15 mm×4.6 mm，3.5 μm)，2，4-二硝基氟苯柱前衍生测定，乙腈与NaAc溶液进行梯度洗脱，柱温33 ℃，流动相流量1 mL/min，检测波长360 nm。

2　结果与讨论

2.1brnFE在C.glutamicumATCC13032和LD320中的序列比对

在谷氨酸棒杆菌中，双组份转运系统BrnFE由基因brnFE编码，负责支链氨基酸L-异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的转运运输，brnFE基因来源于野生型菌株C.glutamicumATCC13032，brnFE1基因来源于L-异亮氨酸生产菌株C.glutamicumLD320。通过序列比对发现，在brnF1基因上有一个突变位点(C419T)，导致了一个氨基酸(Thr140Ile)的改变，在brnE1基因上有一个突变位点(C110G)，导致一个氨基酸(Gln32Arg)的改变。由于LD320是L-异亮氨酸生产菌株，因此brnFE1基因位点的突变可能会加大L-异亮氨酸的外排，进而增加其产量。

2.2LD320/pXMJ19-brnFE和LD320/pXMJ19-brnFE1重组菌株的构建

以L-异亮氨酸生产菌C.glutamicumLD320和C.glutamicumATCC13032基因组DNA为模板克隆brnFE和brnFE1基因片段，将纯化后的PCR产物双酶切后连接到表达载体pXMJ19上，构建出重组质粒pXMJ19-brnFE和pXMJ19-brnFE1，如图1所示。

图1　重组质粒pXMJ19-brnFE 和pXMJ19-brnFE1的构建

将测序验证正确的重组质粒pXMJ19-brnFE、pXMJ19-brnFE1和对照质粒pXMJ19分别电转法转化LD320感受态细胞，用含有氯霉素20 μg/mL的LB平板进行筛选并用引物YZ-F和YZ-R鉴定阳性转化子，所得阳性转化子即为工程菌LD320/pXMJ19-brnFE和LD320/pXMJ19-brnFE1，保存菌株。

2.3不同菌株发酵生产L-异亮氨酸的比较

将构建好的LD320/pXMJ19，LD320/pXMJ19-brnFE和LD320/pXMJ19-brnFE1菌株分别进行摇瓶发酵，以LD320为对照。发酵65 h后，分别取样比较发酵液中不同菌株发酵过程中L-异亮氨酸及副产物积累的差异情况，如图2所示。

1.LD320； 2. LD320/pXMJ19； 3. LD320/pXMJ19-brnFE； 4. LD320/pXMJ19-brnFE1；

图2不同菌株发酵生产氨基酸产量

由图可2知，出发菌株LD320可累积L-异亮氨酸3.66 g/L，亮氨酸0.35 g/L，缬氨酸0.56 g/L。

LD320/pXMJ19中的氨基酸产量有所下降，L-异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的产量分别为3.47 g/L、0.31 g/L和0.50 g/L，分别较出发菌株下降5.2%、11.4%和9.7%，表明空质粒的转入对于菌体合成氨基酸有一定的影响，这可能是由于菌体代谢负担加重的原故。在LD320/pXMJ19-brnFE菌株中的氨基酸产量较出发菌株LD320都只有少许增加，这与Yin等[11]的研究结果相一致。而LD320/pXMJ19-brnFE1菌中L-异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的产量分别为4.44 g/L、0.41 g/L和0.68 g/L，分别较出发菌株提高21%、17.1%和21.8%。可以看出，与野生型brnFE基因相比，过量表达brnFE1基因可以有效增加L-异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸的外排量。说明在突变型brnFE1基因上发生的两个位点(C419T)和(C110G)突变有利于L-异亮氨酸等支链氨基酸的外排，减少了其在胞内的积累，从而削弱了代谢途径中的反馈抑制，使其产量增加。

2.4添加表面活性剂

2.4.1不同表面活性剂对L-异亮氨酸发酵的影响

为进一步增加LD320/pXMJ19-brnFE1工程菌的细胞膜通透性，选择添加阴离子表面活性剂SDS、阳离子表面活性剂NP-10、非离子表面活性剂Tween-20、Tween-40、Tween-80和Triton X-100进行摇瓶发酵实验，采用相同初始浓度0.1 g/L，分别在LD320/pXMJ19-brnFE1发酵0 h添加，发酵65 h后，分别取样测定发酵液中菌体生物量及L-异亮氨酸产量，考察不同表面活性剂对生物量和L-异亮氨酸产量的影响。结果如图3所示。

图3　几种表面活性剂对(a)菌体OD600及(b)L-异亮氨酸产量的影响

由图可知，Tween-80效果最好，对菌体生物量影响不大，同时能够提高L-异亮氨酸的产量，而Tween-20、Tween-40和Triton X-100的添加对L-异亮氨酸产量和生物量都有少许的抑制作用，SDS和NP-10对L-异亮氨酸的产量有明显的抑制作用。因此添加的表面活性剂选定为Tween-80，并对其添加量和添加时间作进一步优化。

2.4.2Tween-80最优添加浓度的确定

将表面活性剂Tween-80设置不同的浓度梯度，在LD320/pXMJ19-brnFE1发酵0 h添加进行摇瓶发酵实验，发酵65 h后，分别取样测定发酵液中菌体生物量及L-异亮氨酸产量，考察其对菌体生物量和L-异亮氨酸产量的影响。结果如图4所示。

由图4可知，在发酵初始阶段(0 h)，较低浓度表面活性剂Tween-80的添加，并不影响菌体生长，且有助于L-异亮氨酸产量的提高。当其浓度达到0.5 g/L时L-异亮氨酸的产量达到最大值，继续增加Tween-80的浓度则对菌体的生长及L-异亮氨酸的产量出现了明显的抑制。当发酵液中Tween-80浓度超过2.0 g/L时细胞干重下降近26%。因此选取0.5 g/L为最优添加浓度。

图4　不同浓度的Tween-80对(a)菌体OD600及(b)L-异亮氨酸产量的影响

2.4.3Tween-80最优添加时间的确定

因为表面活性剂具有改变细胞膜通透性和杀菌作用，不同的加入时间会直接影响细菌的生长和代谢[20]。因此通过改变Tween-80不同的添加时间，寻找最优的添加时间对LD320/pXMJ19-brnFE1发酵产L-异亮氨酸产量有重要意义。选择分别在对数期后的12 h、14 h、16 h和18 h加入终浓度为0.5 g/L的Tween-80进行摇瓶发酵，发酵65 h后分别取样测定L-异亮氨酸产量和生物量，结果见图5。

图5(a)所示为摇瓶中LD320/pXMJ19-brnFE1的生长曲线及Tween-80的添加时间。图5(b)为不同时间点添加Tween-80后L-异亮氨酸产量、菌体生物量及单位细胞产酸量(ILE/DCW=异亮氨酸与菌体干重的比值)。从结果中可以发现，在16 h添加Tween-80时，菌体量为10.31 g/L，L-异亮氨酸产量达到最高点4.71 g/L。LD320/pXMJ19-brnFE1单位细胞合成L-异亮氨酸的能力也达到最高0.46。与对照相比，添加Tween-80使得单位细胞合成L-异亮氨酸的能力得到提高。这可能由于在不影响细胞正常生长的条件下，添加Tween-80提高了细胞膜的通透性，加大了细胞分泌L-异亮氨酸的能力。

2.5发酵罐评价

根据摇瓶优化的结果，在7 L发酵罐上进行了一次性添加Tween-80对LD320/pXMJ19-brnFE1产L-异亮氨酸发酵影响的放大实验。选择添加时间为发酵对数期(16 h)，添加浓度为0.5 g/L，将未加表面活性剂Tween-80的LD320作为对照组。发酵结果如图6。图6(a)所示为LD320对照组的菌体生物量、L-异亮氨酸产量和葡萄糖消耗的曲线，图6(b)为LD320/pXMJ19-brnFE1的菌体生物量、L-异亮氨酸产量和葡萄糖消耗的曲线。

从图中可以看出，在发酵周期内，葡萄糖消耗方面LD320/pXMJ19-brnFE1和对照组的情况几乎一致。菌体生物量方面，由于LD320/pXMJ19-brnFE1菌内携带的质粒和表面活性剂Tween-80的添加使得其生物量始终低于对照组。L-异亮氨酸产量方面，LD320/pXMJ19-brnFE1的产量为25.45 g/L，与对照组的18.53 g/L相比，产量提高了37%左右。

图5　不同时间添加表面活性剂对L-异亮氨酸分批发酵的影响(a)摇瓶分批发酵生长曲线；(b)不同添加时间下的生物量、单细胞产酸、异亮氨酸产量

(a) LD320； (b) LD320/pXMJ19-brnFE1

3　结论

本实验通过在L-异亮氨酸生产菌株C.glutamicumLD320中过表达突变型brnFE1基因和野生型brnFE基因的比较发现，突变型的brnFE1基因能有效加强L-异亮氨酸的外排能力，其摇瓶产量可达到4.44 g/L，较出发菌株提高了21%，而野生型brnFE基因只少量的提高了L-异亮氨酸产量，这表明发生在brnFE1基因上的两个突变位点(C419T)和(C110G) 有利于L-异亮氨酸的外排。

为进一步增加LD320/pXMJ19-brnFE1细胞膜的通透性，本实验通过比较Tween-20、Tween-40、Tween-80、Triton X-100、SDS和NP-10六种表面活性剂发现，Tween-80能够在不影响菌体生长的情况下增加细胞膜的通透性，促进L-异亮氨酸分泌到胞外。对其添加量及添加时间优化后发现，在LD320/pXMJ19-brnFE1对数期16 h加入终浓度0.5 g/L的Tween-80能有效增加L-异亮氨酸的产量。

最后结合brnFE1基因过表达和添加表面活性剂Tween-80优化后的实验结果，在7 L发酵罐上进行了放大实验，在发酵65 h后，LD320/pXMJ19-brnFE1的L-异亮氨酸产量由18.53 g/L到25.45 g/L，相比对照组提高了37%。本研究对于进一步提高谷氨酸棒杆菌的L-异亮氨酸生产能力具有一定指导意义。

[1]Ikeda S，Fujita I，Yoshinaga F．Screening of L-isoleucine producers among ethionine resistant mutants of L-threonine producing Bacteria[J]．Agricultural and Biological Chemistry，1976，40(3)：511-516．

[2]Rose WC，Haines WJ，Johnson JE．The role of the amino acids in human nutrition[J]．Journal of Biological Chemistry，1942，146(2)：683-684．

[3]Blomstrand E．A role for branched-chain amino acids in reducing central fatigue[J]．Journal of Nutrition[J]．Journal of Nutrition，2006，136(2)：544-547．

[4]Park JH，Lee SY. Metabolic pathways and fermentative production of L-aspartate family amino acids[J]．Biotechnology Journal，2010，5(6)：560-577．

[5]Kind S，Jeong WK，Schröder H，etal．Systems-wide metabolic pathway engineering inCorynebacteriumglutamicumfor bio-based production of diaminopentane[J]．Metabolic Engineering，2010，12(4)：341-351．

[6]Kind S，Kreye S，Wittmann C．Metabolic engineering of cellular transport for overproduction of the platform chemical 1，5-diaminopentane inCorynebacteriumglutamicum[J]．Metabolic Engineering，2011，13(5)：617-627．

[7]Park SD，Lee JY，Sim SY，etal．Characteristics of methionine production by an engineeredCorynebacteriumglutamicumstrain[J]．Metabolic Engineering，2007，9(4)：327-336．

[8]Morbach S，Sahm H，Eggeling L．Use of feedback-resistant threonine dehydratases ofCorynebacteriumglutamicumto increase carbon flux towards L-isoleucine[J]．Appl Environ Microbiol，1995，61(12)：4315-4320．

[9]Kennerknecht N， Sahm H， Yen MR，etal．Export of L-Isoleucine fromCorynebacteriumglutamicum： a two-gene-encoded member of a new translocator family[J]．Journal of Bacteriology，2002，184(14)：3947-3956．

[10]Trotschel C，Deutenberg D，Bathe B，etal．Characterization of methionine export inCorynebacteriumglutamicum[J]．Journal of Bacteriology，2005，187(11)：3786-3794．

[11]Yin L，Shi F，Hu X，etal．Increasing L-isoleucine production inCorynebacteriumglutamicumby overexpressing global regulator Lrp and two-component export system BrnFE[J]．Journal of Applied Microbiology，2013，114(5)：1369-1377．

[12]梅建凤，航闵．生物表面活性剂及其应用[J]．工业微生物，2001，31(1)：54-57．

[13]Nemec T，Jernejc K．Influence of Tween 80 on lipid metabolism of anAspergillusnigerstrain [J]．Applied Biochemistry and Biotechnology，2002，101(3)：229-238．

[14]朱艳，袁其朋，王航．添加氧载体及表面活性剂对番茄红素发酵的影响[J]．微生物学通报，2006，33(1)：90-94．

[15]韦祎，张淑荣，刘春巧等．添加表面活性剂对α-熊果苷发酵的影响[J]．化工学报，2007，58(9)：2352-2356．

[16]余秉琦，沈微，诸葛健．适于异源DNA高效率整合转化的谷氨酸棒杆菌电转化法[J].中国生物工程杂志，2005，25(2)：78-81．

[17]van der Rest ME，Lange C，Molenaar D．A heat shock following electroporation induces highly effcient transformation ofCorynebacteriumglutamicumwith xenogeneic plasmid DNA[J]．Appl Microbiol Biotechnol，1999，52(4)：541-545．

[18]许彦芳，许新民，王永利．高效液相色谱柱前自动衍生法测定氨基酸含量[J]．河北医科大学学报，1996，17(3)：132-134．

[19]何晨光，马雷，徐庆阳等．用高效液相色谱定量分析分支链氨基酸[[J]．生物技术通讯，2009，20(4)：556-558．

[20]卫云路，宁正祥，郑成．新型表面活性剂在谷氨酸发酵中的应用[J]．现代食品科技，2009，25(3)：289-295．

Effects of overexpressing two-component export system BrnFE and adding surfactants on L-isoleucine production byCorynebacteriumglutamicum

LI Zhong-cai1,2, DONG Hui-na2, CONG Li-na1, ZHANG Da-wei2

1. School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China

In order to increase L-isoleucine productivity inCorynebacteriumglutamicumLD320, the L-isoleucine secretion system was improved. Both the mutatedbrnFEoperon and the wild typebrnFEoperon were cloned into the shutter expression vector pXMJ19 individually, and the resultant plasmids pXMJ19-brnFEand pXMJ19-brnFE1 were transformed into LD320. Then the L-isoleucine production by these two strains was compared and analyzed. More L-isoleucine was produced by LD320/pXMJ19-brnFEthan that by LD320/pXMJ19-brnFE1. In addition, the effects of several surfactants on growth and L-isoleucine production by LD320/pXMJ19-brnFE1 were investigated. The shaking flask results revealed that Tween-80 played a key role in cell growth and L-isoleucine production. The suitable concentration of Tween-80 was 0.5 g/L and the optimal adding time was 16 h. Furthermore, the effects of Tween-80 on cell growth and L-isoleucine production by LD320/pXMJ19-brnFE1 was also investigated in a 7 L fermentor. The concentration of L-isoleucine increased from 18.53 g/L to 25.45 g/L, which was 37% higher than that of the control strain.

BrnFE; surfactants;Corynebacteriumglutamicum; L-isoleucine

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.001

国家自然基金(31370089)，天津市科技支撑计划重点项目(14ZCZDSY00065)，天津市自然科学基金(16JCYBJC23500，15JCQNJC09500)。

李忠财(1989～)，男，硕士研究生。E-mail:li_zhc@tib.cas.cn。

丛丽娜(1962～)，女，教授。E-mail:linacong@163.com；张大伟(1978～)，男，研究员。E-mail:zhang_dw@tib.cas.cn。