植物乳杆菌高活力保存方法的研究及其应用

刘鹏扬，　刘军义，　吕春秋，　卢　炜，　赵永锋

1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广西 南宁 530021



植物乳杆菌高活力保存方法的研究及其应用

刘鹏扬1，刘军义2*，吕春秋2，卢炜2，赵永锋2

1.上海海洋大学 食品学院，上海 201306；2.广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心，广西 南宁 530021

本研究旨在探讨植物乳杆菌的高活力保存方法，为植物乳杆菌饲料添加剂规模化、工业化生产奠定基础。采用4 ℃低温保存法、36 ℃烘干后常温保存法、阳离子活性载体保存法等3种方法对植物乳杆菌进行活力保存比较试验。以保存后活菌数不低于原值50%为参照标准，结果显示，对照组可保存15 d，4 ℃低温保存法可保存30 d，36 ℃烘干后常温保存法只能保存一周，而阳离子活性载体保存法则可保存2个月以上。结果表明，阳离子活性载体保存法可应用于植物乳杆菌饲料添加剂的规模化、工业化生产实践中。

植物乳杆菌； 高活力； 保存方法； 活性载体； 规模化

乳酸菌是指发酵糖类后主要产物为乳酸的一类没有芽孢、革兰氏阳性细菌。早在5000年前，人类就已经利用乳酸菌，如制作泡菜、酸奶等。研究表明，乳酸菌对人的健康和长寿非常重要。目前，乳酸菌主要应用于乳制品，如日本，乳酸菌制品已占乳制品市场的85%。近年来，为了应对饲料抗生素残留之风险，以乳酸菌为主力军的微生态制剂开始兴起。由于乳酸菌及其代谢产物除了可提高养殖对象的生长速度、存活率，并具有防病、治病、增强机体免疫力的功效以外，还可以提高饲料的品质，提升饲料的利用率。作为添加剂与传统的抗生素、化学药物相比，具有无公害、安全、高效的优点，因此大有推广普及之势[1]。

植物乳杆菌是乳酸菌的一种，最适生长温度为30 ℃～35 ℃，厌氧或兼性厌氧，菌体细胞为直或弯的杆状，单个、有时成对或成链状，最适pH 6.5左右，属于同型发酵乳酸菌[2]。植物乳杆菌与人类的生活关系密切，是一种常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中的乳酸菌，能定植于肠道发挥有益作用。它对肠道微生物菌群有重要影响，在食品发酵、工业乳酸发酵以及医疗保健等领域都具有很强的应用潜力。近年来，随着食品、饲料等需规模化生产的产品对发酵工艺的要求逐步提高，摸索发酵添加剂的高效高活力保存及安全使用便显得更加重要。然而乳酸菌活力较弱，保存较为困难，迄今为止，最有效的保存方法仍然是真空冷冻干燥法[3]，此法可使乳酸菌保存3个月以上[4]。但此方法仅适用于菌种的保存而难被用于生产实践。随着乳酸菌饲料添加剂使用量的逐年增大，急需解决乳酸菌的大批量、常温、高活力保存问题，从而为微生物作为饲料添加剂用于规模化生产奠定基础。为此，研究者们进行了多方研究，如王成涛等人[5]研究了五味中草药对乳酸菌生长及保存活力的影响，发现室温条件下保存l周、2周、4周植物乳杆菌LP-2，加入l%青蒿的培养液，保存4周后比对照组活菌数增加了2.5倍；林燕文[6]研究了木棉花对乳酸菌生长及保存活力的影响，发现保存3周后，含有5%木棉花浓度的植物乳杆菌液中的活菌数为空白对照的16倍。然而，这些研究没有给出保存后与保存前活菌数的比较情况，而且研究观察的持续时间不够长，实际操作也存在一定的困难，因此未见实际应用。

菌种保存的具体方法很多，原理却大同小异。其核心内容就是要创造一个适合其稳定生存的环境条件，诸如干燥、低温、缺氧、避光、营养缓释以及添加保护剂或酸度中和剂等。目前的菌种主流保存方法包括传代培养保存法、液体石蜡覆盖保存法、冷冻保存法、冻干保存法、载体保存法等。在实践中，如传代培养法、冷冻干燥法等菌种保存方法只适用于少量菌种的长期保存，成本较高，对环境条件要求很严格，不适用于在普通环境下保持乳酸菌高活力以及便于生产大批量乳酸菌菌剂的生产实践。与前几种传统保存方法相比，载体保存法则具有载菌量大、成本低廉、对环境要求低、菌种保存活力高、适用于生产实践等优点，近年来被广泛开发应用。菌种载体保存法的原理在于：使生长合适的微生物吸附在一定的具有特殊吸附能力的物质上，使微生物保持生存状态以达到微生物长期保存的目的。常见的载体有土壤、砂土、硅胶、明胶、麸皮、 磁珠和滤纸片等。本文通过对乳酸菌的活力保存进行了持续研究，提出了一种采用阳离子载体为介质的、大批量、常温、高活力的乳酸菌常温保存方法。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种

选用两种来源植物乳杆菌作为供试菌种：一种为本实验室分离保存，标记为L199，另一种购自美国杜邦公司型号为Lactobacillusplantarum-115植物乳杆菌，标记为Lp-115。将以上两种菌种接种于灭菌的MRS液体培养基[7]中保存备用，是为菌种保存液。MRS液体培养基的配方是：蛋白胨 10.0 g，牛肉粉 5.0 g，酵母粉 4.0 g，葡萄糖 20.0 g，吐温80 1.0 mL，K2HPO4·7H2O 2.0 g，醋酸钠·3H2O 5.0 g，柠檬酸三铵2.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.2。

1.1.2马蹄汁

参照周爱梅等人的方法[8]进行制作。鲜马蹄去皮，清洗，烫漂后，匀浆，纱滤，3 000 g离心15 min，取上清，调可溶性固形物至1%。可溶性固形物用手持式折光仪测定、读数。

1.1.3植物乳杆菌培养液

将L199以及Lp-115菌种保存液以1︰10的比例接种于马蹄汁中，30 ℃培养24 h，是为L199与Lp-115植物乳杆菌培养液。

1.2方法

设计植物乳杆菌培养液的3种保存方法，L199分别编号为1#、2#、3#，Lp-115分别编号1’#、2’#、3’#，具体如下：

1#、1’#：低温保存法。培养液直接置4 ℃下保存。

2#、2’#：烘干保存法。将L199及Lp-115培养液以1︰1的比例与预先烘干麸皮(M/M)混合，36 ℃，24 h烘干，然后置室内自然环境下保存。

3#、3’#：阳离子活性载体保存法。将L199及Lp-115培养液与阳离子活性载体和麸皮按2︰1︰1的比例(M/M)均匀混合，然后置室内自然环境下保存。

两菌种培养液对照标记为4#、4’#，培养液直接置室内自然环境下保存，自然环境下温度作为本试验的常温。

试验开始时，测定样品的乳酸菌数，然后每隔一周检测一次，半个月后，每15 d检测一次，试验持续进行2个月，当乳酸菌数减少4个数量级时，停止计数。乳酸菌数的测定按GB 4789.35-2010方法[7]执行。

试验结束时，计算各保存方法下样品中乳酸菌数与同期对照样品的比值，同时计算它们与对照样品初始值的比值。

2　结果

试验持续60 d，其中，室内平均气温为22 ℃。试验结果如表1所示。

从表中可以看出，植物乳杆菌L199和Lp-115培养液在4 ℃低温下保存2个月之后，有效活菌数分别为为8.0×107CFU/mL和1.2×108CFU/mL，分别是各自常温下放置对照样品的4倍和3倍，分别是各自初始活菌数的27%和18%；烘干后常温下保存， 1个月时有效活菌数已分别降低了4个数量级和3个数量级，2个月后的有效活菌数与初始活菌数相比，均几近为零；用活性载体保存法，常温下放置2个月，其有效活菌数分别为1.3×109CFU/mL和1.5×109CFU/mL，是各自常温下放置对照样品的65倍和50倍，是各自初始活菌数的5.2倍和4.7倍。结果表明，活性载体常温保存法是比较好的一种乳酸菌活力保存法。

表1　3种保存方法对L199乳酸菌活力的影响结果

“/”表示未检测。

根据表中数据作出3种保存方法对乳酸菌活力保存影响的曲线图，结果示如图1。

图1　3种保存方法对受试乳酸菌活力保存的影响

从图中可以看出，植物乳杆菌的确比较“娇嫩”，若以活菌数减少不多于50%作为产品保存合格标准，则常温下，两种受试植物乳杆菌L199和Lp-115只能保存15 d左右，置4 ℃低温下均只能保存30 d左右，烘干后置常温下两种受试植物乳杆菌均不超过一周，甚至在15 d左右时，几乎全部失活。但是，用阳离子活性载体进行保存，结果却出乎意料的好，在前15 d，两受试植物乳杆菌有效活菌数不仅没有减少，而且还大幅上升，均几近10倍，然后处于较稳定的状态，即使在保存2个月之后，有效活菌数均保持1.0×109CFU/mL以上。

3　讨论

本研究采用马蹄汁为植物乳杆菌的培养液，是因为我国是马蹄之乡，每年有大量的马蹄淀粉废水排放，而所谓的废水，其实质就是马蹄汁，因此本研究一开始就具有较强的现实意义。乳酸菌活力保存是世界性难题，所以现有乳酸菌活菌产品均需冷链销售，且保质期不超过30 d[9]，本研究也发现4 ℃低温下，超过30 d其活力则减半。热风喷雾干燥的乳酸菌，数量只有(7.2±0.4)×102CFU/g[10]，本试验也发现烘干法不适合乳酸菌的保存，即使采用低温(36 ℃)烘干法然后常温保存，活菌数也迅速减少，30 d后，只有1×104CFU/g。目前，乳酸菌饲料添加剂还没有制订出国家或行业标准，可能与常温下乳酸菌剂的活力保存问题没有解决有关。

令人兴奋的是，本文以植物乳杆菌L199和Lp-115为试验菌株，发现用阳离子活性载体进行常温保存，效果良好，即使保存2个月，活力仍未见降低，活菌数保持在109CFU/g以上，而且与对照相比，L199的有效活菌数还达到令人惊奇的65倍。这种良好的效果除了得益于载体本身的保护作用外，可能还与阳离子载体的中和作用和麸皮的营养作用有关，一方面，阳离子载体中的物质与乳酸进行中和，解除了乳酸对植物乳杆菌生长的抑制作用，另一方面，处在半湿润状态下的麸皮不断缓慢释放出营养因子，为乳酸菌的持续生长和代谢提供了良好条件，因此才会出现如此奇特的效果。与此同时，此阳离子载体属于天然矿物质，自然界中保有量巨大，且容易获得，已广泛用于生物医药、食品加工、水产养殖以及水体环境净化，应用前景广阔。以此为据，本研究还试制了5 000 kg的乳酸菌饲料添加剂样品提供给广西某大型家禽养殖集团和众多养殖户进行试用，反馈的结果是：其肉鸡养殖全程可以不施用抗生素等药，特别明显的是鸡苗病死率降低46%以上，肉鸡生长率提高17%，料肉比降低8.4%。

阳离子活性载体保存乳酸菌技术的进一步研究和应用，将推动相关标准的制订，实现乳酸菌饲料添加剂生产的革命，从而大大推动乳酸菌在畜禽水产养殖业的应用，促进养殖业的健康发展。

[1]郑坚, 罗冬英. 乳酸菌在养禽业中的应用研究现状及存在问题[J]. 安徽农业科学,2002，30(4)：507-508.

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Methods forLactobacillusplantarumvitality preservation

LIU Peng-yang1, LIU Jun-yi2, LV Chun-qiu2, LU Wei2, ZHAO Yong-feng2

1. College of Food Science & Technology Shanghai Ocean University, Shanghai 201306； 2. Technology Center of Guangxi Entry-Exit Inspection & Quarantine Bureaue, Naning 530021

Methods forLactobacillusvitality preservation were investigated in order to find a good method which can be used for large scale production ofLactobacillusfeed additive. The methods such as stored at 4 ℃, dehydrated at 36 ℃ and using calcium ion active carrier absorption to preserveLactobacillusplantarumwere compared. With a standard that the valid bacteria was not less than 50% while being treated, the control sample could be preserved for 15 days; stored at 4 ℃ could be kept for 30 days; dehydrated at 36 ℃ could only last for one week; while using positive ion active carrier, it could be preserved for more than 2 months. As a result, the method using calcium ion active carrier preservation could be applied in large scale production ofLactobacillusfeed additive.

Lactobacillusplantarum; vitality; preservation; active carrier; large-scale

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.005

广西科技基础条件平台建设项目(14-87-01A)。

刘鹏扬(1995～)，男，大学本科学生。E-mail：550467974@qq.com。

刘军义(1966～)，男，研究员，博士，长期从事微生物应用研究工作。E-mail：ljy8463@163.com。