氧化石墨烯/十二烷基二甲基苄基氯化铵复合物的制备和抗菌性能研究

叶小莉，　施庆珊，　谭绍早

1.广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室,广东 广州 510070；2.暨南大学化学系,广东 广州 510632



氧化石墨烯/十二烷基二甲基苄基氯化铵复合物的制备和抗菌性能研究

叶小莉1,2，施庆珊1*，谭绍早2

1.广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室 广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室,广东 广州 510070；2.暨南大学化学系,广东 广州 510632

本文研究了氧化石墨烯/十二烷基二甲基苄基氯化铵(GO-1227)复合抗菌材料的制备及其抗菌性能。通过傅立叶红外光谱的检测，确定GO-1227复合物已经成功合成。为了研究复合物的抗菌活性，以大肠杆菌为代表，通过观察大肠杆菌的表面形貌变化和细菌体外离子浓度变化，证明GO-1227复合物具有相对于原材料更好的抗菌性能。

氧化石墨烯； 十二烷基二甲基苄基氯化铵； 纳米复合材料； 抗菌性

在最近几年，大量的复合物抗菌剂已经得到快速发展。因为在日常生活和生产环境中，细菌可以很容易地生存和繁殖，如饮用水、水产养殖业、行业的循环冷却、石油、化工、电力和纺织等水系统。细菌的存在会导致流体系统被腐蚀而停工。此外，它可能会导致严重的健康问题，涉及有关医疗装置的感染，甚至食品工业的污染[1]。因此，抗菌材料在我们的生产和生活中发挥着越来越重要的作用，提高抗菌性和抗菌剂使用效率已成为一个重要的研究课题[2，3]。

自从发现了十二烷基二甲基苄基氯化铵(1227)具有更好的抗菌性能后，1227作为消毒剂得到了广泛的研究和应用[4，5]。尽管1227抗菌性很好，但是其分子很容易团聚， 导致其抗菌性不能被充分利用。为了解决这个问题， 科研工作者制备了季铵盐复合抗菌材料， 通过将季铵盐负载到各种载体上， 制备出分散性良好的复合抗菌材料，如：以碳材料为载体。氧化物石墨烯(GO)是一种众所周知的含有羧基、羟基和环氧官能团的致密蜂窝结构的碳原子层[6]，并具有良好的抗菌性[7]。

本论文以氧化石墨烯、十二烷基二甲基苄基氯化铵等为原料， 制备了分散性良好的GO-1227复合材料。从材料结构和抗菌性能两个角度进行研究，通过傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)检测手段，证明抗菌复合材料制备成功，以及其具有更优异的抗菌性能[8]。本研究结果对于减少有害微生物对资源的损耗、降低致病微生物对人类健康的威胁具有重要意义。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器

试剂：自制氧化石墨烯(GO)，十二烷基二甲基苄基氯化铵(1227)，氯化钠，实验室自制去离子水。药品均为分析纯。

仪器：搅拌器，离心机，烧杯，试管，冷冻干燥箱，空气摇床。

1.2实验过程

将采用Hummers 法[6]制备的氧化石墨烯洗净，干燥，备用。取0.05 g的氧化石墨烯均匀分散在20 mL蒸馏水中，再向其加入0.2 g十二烷基二甲基苄基氯化铵，室温下搅拌4 h后，用超纯水清洗和离心三次，然后，再冷冻干燥，得到氧化石墨烯-十二烷基二甲基苄基氯化铵(GO-1227)纳米复合物。

1.3纳米复合材料的表征

采用Nicolet6700傅里叶变换红外光谱仪(FTIR)，从400 cm-1记录到4 000 cm-1观察复合物结构；采用Philip TECNAI-10透射电子显微镜(TEM)观察样品的形貌；采用电感耦合等离子光谱(ICP)测试复合物的细菌体外离子浓度。

1.4TEM样品制备

首先将培养基和实验用品放入灭菌锅中，121 ℃灭菌20 min。然后在无菌室将大肠杆菌从斜面刮下，加入到10 mL液体LB培养基中37 ℃活化8 h，取出，用0.8wt.%生理盐水离心洗涤3次。将等量的细菌分别加入到事先准备好的10 mL空白生理盐水、一定浓度1227、GO悬浮液和GO-1227悬浮液中，使菌体浓度为1010CFU/mL。37 ℃下恒温培养24 h。取出少量，进行TEM测试。

1.5抗菌性能测试

利用细菌体外离子浓度变化来探究复合物对大肠杆菌的抗菌性能。分别向试管中加入生理盐水、一定浓度1227、GO悬浮液和GO-1227悬浮液，然后分别混入用0.8%盐水稀释的105～106CFU/mL大肠杆菌ATCC25922。将上述四支试管放置在37 ℃的空气摇床中振动培养24 h。分别取0 h和接触24 h之后的溶液，进行过滤、消化，分别测试K+,Ca2+，Na+，Mg2+等金属浓度。重复测试三次。

2　结果与讨论

2.1物相分析

用傅里叶变换红外光谱探测样本的化学结构。图1为(a)GO(b)1227(c)GO-1227的红外光谱。GO在3 420 cm-1处出现O—H伸缩振动峰，这可能是来自于空气当中的水分。除了这一点，还在1 729 cm-1、1 634 cm-1、1 396 cm-1和1 094 cm-1处出现吸收峰，它们分别属于C=O、C=C、C—OH和C—O—C官能团的振动频率。特别是1 729 cm-1处的C=O吸收峰，是氧化石墨烯最明显的特征峰[9,10]。可见，石墨已经成功被氧化成氧化石墨烯。从原料1227的红外谱图可以看出，1227在2 922 cm-1、2 851 cm-1、1 638 cm-1和1 474 cm-1处出现—CH3、—CH2、C=C和N—CH3等的特征吸收峰。然而，复合物GO-1227在2 922 cm-1、2 851 cm-1、1 729 cm-1、1 638 cm-1和1 474 cm-1等处出现吸收峰，分别为—CH3、—CH2、C=O、C=C和N—CH3基团的特征峰，表明红外谱图包含了GO和1227的特征峰。可见本实验已成功合成纳米复合物GO-1227。

图1　(a)GO (b)1227 (c)GO-1227的红外光谱图

2.2形貌分析

用TEM观察被生理盐水、GO、1227和GO-1227分别作用过的革兰氏阴性大肠杆菌的形貌(图2)。对于空白对照，用生理盐水保存24 h后细菌仍具有完整的鞭毛、细胞壁和细胞其他组成。与空白对照的细胞对比，被GO、1227和GO-1227处理后的细胞在图片中显示出明显的差异。对于GO处理的细胞，细胞质壁分离，鞭毛消失了，细胞壁有显著变化，细胞壁已有明显损坏。用1227处理过的细菌细胞壁有更明显的变化，大肠杆菌的细胞壁已被完全分离，并且只有细胞内膜和外膜被留下。然而，对于GO-1227，除了细胞壁有明显的分离之外，细胞内的物质也有溢出的迹象。从这些图像中，可以得出结论，GO-1227能够非常有效地改变细菌细胞膜的渗透性。

图2　经(a)空白、(b)GO、(c)1227和(d)GO-1227分别作用过的大肠杆菌形貌图

2.3材料抗菌性分析

大多数细菌都有 “吸钾排钠” 的功能，也就是指维持细胞内外K+和Na+浓度差。这个功能对于维持细胞基础电位和确保细胞内外的离子渗透平衡具有重要作用。然而，当细菌接触了抗菌剂之后，细胞的这种功能被破坏。从图3可以看出，细菌与抗菌材料作用24 h后，细胞体外的K+和Na+的含量比未处理的细菌显著高得多，表明抗菌复合物能使细菌细胞膜通透性变大或损坏，所以造成细菌体内的K+和Na+离子溢出。然而，用GO-1227处理细菌细胞体外的K+和Na+离子含量比用GO和1227处理的更高，这进一步说明GO-1227的抗菌性更好。另一方面，相比于未处理的细菌，用抗菌材料处理过的细菌细胞体外的Ca2+和Mg2+的含量稍有增加。因为细菌细胞膜的通透性增加，Ca2+和Mg2+通过离子浓度梯度的差异释放到外部。因此，抗菌复合物GO-1227改变细菌的渗透性并打破离子浓度的平衡，从而证明其具有很强的抗菌效果。

图3　抗菌材料处理24 h后大肠杆菌胞外离子浓度变化柱形图

3　总结

本研究以氧化石墨烯、十二烷基二甲基苄基氯化铵等为原料，成功制备了分散性较好的GO-1227复合材料。对其抗菌性能进行了分析，结果表明，单一组分的氧化石墨烯和1227有较小的抗菌效果，而GO和1227复合得到GO-1227复合物，其抗菌性得到很大的提升，对大肠杆菌具有良好的抗菌性能。不仅因为复合材料具有更优良的比表面积和防止1227聚集的功能，从而使得复合物抗菌剂更容易吸附细菌，还由于两种原料本身都具有抗菌性，因此提高了GO-1227复合物的抗菌性能。

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Preparation of graphene oxide/dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride complex and its antibacterial properties

YE Xiao-li1, 2， SHI Qing-shan1， TAN Shao-zao2

1. Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong, Guangzhou, 510070 2. Jinan University, Guangdong, Guangzhou, 510632

Preparation of graphene oxide/dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride (GO-1227) complex and its antibacterial properties were described in this articale. The antibacterial properties of GO-1227 were investigated by bacterial surface morphology and ion concentration outside the cell dealt with the antimicrobial agent. The results showed that the obtained GO-1227 complex displayed enhanced antibacterial properties．

graphene oxide; dodecyl dimethyl benzyl ammonium chloride; nanocomposite; antimicrobial properties

10.3969/j.issn.1001-6678.2016.04.010

广东省科技计划项目资助(项目编号: 2013B050800023，2013B090600148)。

叶小莉(1991～)，女，在读硕士生。Tel：020-87137649， E-mail：954740745@qq.com。

施庆珊(1966～)，男，研究员。E-mail：shiqingshan@hotmail.com。