莲子淀粉纳米晶的制备及其结构特性研究

黄敏丽, 曾木花, 刘思迪, 林靖颖, 邱玉松, 谢峻彬, 郭泽镔

(福建农林大学食品科学学院1，福州 350002) (福建省特种淀粉品质科学与加工技术重点实验室2，福州 350002)

莲子是我国重要的特产经济资源，为睡莲科植物莲(NelumbonubiferaGaertn.)的果实或种子，莲子已被我国卫生部列入87 种药食两用食物名列[1]。莲子淀粉是一种直链淀粉质量分数高达42%的特异性淀粉，结晶结构为C型[2]。莲子淀粉的分子结构具有主链长、支链短、分支度少的特点，导致其易返生[3,4]。此外，莲子淀粉遇冷水不溶，热水糊化后黏度大，乳化能力差，这些不足限制了莲子淀粉在食品加工中的应用[5]。

淀粉纳米晶是指淀粉经过改性处理后去除淀粉颗粒无定形的非结晶区域后得到的纳米尺寸的结晶体或半结晶体[6]。其优点在于力学性能强，表面能较高，还具备无机纳米颗粒没有的生物可再生性，生物相容性，可降解性[7]。淀粉纳米晶常作为填充剂和乳化剂等应用于食品领域[8,9]，肖茜等[10]研究表明，在大米淀粉食用膜中添加淀粉纳米晶可以提高食用膜的完整性、致密性、水蒸气透过率、热稳定性；Alizadeh等[11]研究表明，淀粉纳米晶可作为制备生物活性包衣液的原料应用于鸡肉片保鲜。

目前，淀粉纳米晶的制备方法主要有酸解法、酶解法、物理法等[12]。酸解法是制备淀粉纳米晶最常用的方法，操作最为简单方便且能够较好地保留淀粉纳米晶的结晶区域[13]。酶解法的优点在于反应速度快，但存在产率低和制备的淀粉纳米晶理化性质不稳定等缺点[14]。物理法包括高压均质法、超声波法等，物理法容易破坏淀粉颗粒的结晶结构，较少单独用于制备淀粉纳米晶，常与其他方法复合使用[15,16]。

本研究以C型结晶结构的莲子淀粉为原料，采用不同浓度的硫酸水解莲子淀粉得到莲子淀粉纳米晶，通过激光粒度分析、扫描电子显微镜、X-射线衍射、傅里叶变换红外光谱和凝胶渗透色谱等方法对莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的结构特性进行表征，以期为莲子淀粉纳米晶的制备工艺优化及理化和功能特性研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

速冻鲜莲；浓硫酸(分析纯)；所用其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

HX-PB1058破壁机， L550离心机，FDU-1200冷冻干燥机， JSM-6360LV扫描电镜，Mastersizer 3000激光粒度分析仪，TDA305max凝胶渗透色谱仪，Bruker AXS X-射线衍射仪，Tensor 27傅里叶红外光谱仪。

1.3 方法

1.3.1 莲子淀粉的提取

莲子淀粉的提取参考郭泽镔[20]的方法，略作修改：速冻鲜莲在室温下解冻并洗净去芯后，将其与去离子水按照1∶3混合，使用破壁机进行打浆，浆液用120目食品级尼龙布进行过滤，弃滤渣留滤液。滤液于25 ℃下静置24 h，收集沉淀物。沉淀物用去离子水反复清洗三次去除杂质，再用95%无水乙醇反复清洗三次去除脂质。最终得到的沉淀物放入45 ℃烘箱干燥24 h后研磨过100目筛得到莲子淀粉，置于干燥器中保存备用。

1.3.2 莲子淀粉纳米晶的制备

酸水解制备莲子淀粉纳米晶：根据Angellier等[21]的方法并进行一些修改。将15 g莲子淀粉加入到装有100 mL硫酸溶液的锥形瓶中，硫酸浓度分别为3.0、3.5、4.0 mol/L，锥形瓶放入40 ℃水浴锅中以200 r/min的搅拌速度分别反应1、3、5 d。反应结束后，悬浮液用蒸馏水反复清洗至中性，将离心后的沉淀物冷冻干燥，得到白色粉末状样品。

1.3.3 扫描电镜(SEM)观测

孙 悦 女，1991年出生于安徽阜阳.硕士，研究实习员，主要研究方向为嵌入式测控技术、数据采集处理技术.

将少量样品点在贴有导电胶布的硅片上，用洗耳球吹去多余的浮粉，真空状态下喷金10 min。喷金后的样品放置到检测台上，在加速电压为20 kV，放大倍数10 000倍的条件下进行观察。

1.3.4 粒度测定

将适量样品溶于去离子水中，再将该溶液分散在激光粒度仪的分散槽中，使遮光度达到8%～10%。分散剂折射率为1.33，样品折射率为1.53，测定莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的粒径分布。每个样品平行测定3次。

1.3.5 分子质量(GPC)测定

采用凝胶渗透色谱法测定莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的分子质量。10 mg样品分散在10 mL二甲基亚砜中，100 ℃加热2 h后在60 ℃磁力搅拌水浴锅中搅拌6 h。加热结束后，样品液用0.45 μm尼龙过滤器进行过滤，对滤液进行测定分析。以折光指数增量(dn/dc)为0.072计算样品的分子质量。流动相的流速为0.5 mL/min。

1.3.6 X-射线衍射(XRD)测定

采用广角X-射线衍射仪对莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的X射线衍射图进行测定。测量条件为：Cu-kα辐射(λ=1.540 6 Å)的电压为40 kV，电流为200 mA，测量范围为3°～40°，扫描速率为2(°)/min，步宽为0.002°。相对结晶度的计算方法参考张本山等[22]的方法。

1.3.7 傅里叶红外光谱(FTIR)测定

采用傅里叶变换红外光谱分析仪对莲子淀粉和子淀粉纳米晶的红外光谱图进行测定。2 mg样品与100 mg无水KBr在石英研钵中进行充分研磨后使用压片机对混合粉末进行压片处理。扫描范围为4 000～400 cm-1，扫描次数为32，分辨率为4 cm-1。

2 结果与分析

2.1 莲子淀粉纳米晶颗粒形貌分析

采用场发射扫描电子显微镜观测的莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的颗粒形貌如图1和图2所示。图1为莲子淀粉，其大部分的结构为表面光滑的椭圆形和圆形，少部分为不规则形状，这与课题组前期研究结果一致[23]。图2a、图2b、图2c分别为硫酸浓度3.0 mol/L条件下分别酸水解1、3、5 d制备的莲子淀粉纳米晶，图2a中大部分颗粒形状没有变化，但颗粒表面变为粗糙且有少量颗粒碎片，图2c中颗粒原本的椭圆形状已经完全被破坏，全部颗粒变为不规则形状。研究结果表明酸水解最先作用于莲子淀粉表面，将表面破坏后硫酸进入莲子淀粉颗粒内部破坏淀粉结构，表明硫酸水解为外腐蚀模式[24]。图2d、图2e、图2f为硫酸浓度3.5 mol/L条件下分别酸水解1、3、5 d制备的莲子淀粉纳米晶，e和f中颗粒发生严重团聚形为块状结构，块状体的形成与莲子淀粉颗粒中的直链淀粉含量较多有关，LeCorre等[25]的研究表明淀粉颗粒中的直链淀粉会堵塞酸水解的途径从而形成更大的颗粒；此外还可能与酸水解后颗粒碎片带有羟基有关，羟基易形成氢键，使碎片容易聚集[26]。图2g、图2h、图2i为硫酸浓度4.0 mol/L条件下分别酸水解1、3、5 d制备的莲子淀粉纳米晶，图2i中的块状团聚体表面被破坏，出现许多方形片状和球型结晶且方形片状结晶多于球型结晶。

由莲子淀粉纳米晶的扫描电子显微镜图可得出酸水解制备莲子淀粉纳米晶的一般规律为：硫酸对莲子淀粉酸水解作用先从表面开始，使得莲子淀粉光滑的表面变得粗糙并出现凹陷；随着酸水解天数的增加莲子淀粉颗粒逐渐解体为大量的碎片，碎片团聚形成表面光滑的块状团聚体；该块状团聚体在后续酸水解过程中表面变得粗糙，边缘片层结构的结晶体暴露出来，球型结晶体在片状结晶体后出现。此外，硫酸浓度的增加加快了淀粉纳米晶的生成速度。

Lecorre等[25]研究了糯玉米淀粉(A型)、小麦淀粉(A型)、高直链玉米淀粉(B型)和马铃薯淀粉(B型)为原料制备的淀粉纳米晶的形态特性，结果表明A型淀粉纳米晶的形状为平行六面体和方型，B型淀粉纳米晶的形状为圆形和圆角正方形。莲子淀粉为C型结晶结构淀粉，是A型结晶结构和B型结晶结构的混合结构，扫描电镜结果表明以莲子淀粉(C型)为原料制备的莲子淀粉纳米晶同时包含了A型淀粉纳米晶和B型淀粉纳米晶的颗粒形貌特征。

图1 莲子淀粉的电镜图

注：小标题的浓度和时间分别代表硫酸浓度和酸水解时间。图2 莲子淀粉纳米晶的电镜图

2.2 粒径分析

采用马尔文激光粒度仪测定的莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的粒径分布如图3所示。莲子淀粉粒径分布范围为4～21 μm，这与课题组前期研究结果一致[23]。硫酸浓度为3.0、3.5 mol/L制备的莲子淀粉纳米晶的粒径分布明显向左偏移，但没有达到纳米级别。当硫酸浓度为4.0 mol/L时，水解5 d制备的莲子淀粉纳米晶的粒径分布范围为0.01～7.64 μm，粒径分布出现双峰是因为酸水解后得到的莲子淀粉纳米晶粒子表面存在羟基，易形成氢键，所以其自聚集趋势很强，团聚导致大颗粒的形成[26]。

图3 莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的粒径分布

表1 莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的粒径分布

表1中D[3,2]表示表面积平均直径，D[4,3]表示体积平均直径，D(10)、D(50)和D(90)分别表示小于该直径的颗粒数占颗粒总量的10%、50%和90%。莲子淀粉与莲子淀粉纳米晶在D[3,2]、D[4,3]、D(10)、D(50)和D(90)上都存在显著性差异(P<0.05)。此外，当硫酸浓度相同时，反应1、3、5 d的莲子淀粉纳米晶的D[3,2]、D[4,3]、D(10)、D(50)和D(90)上也存在显著性差异(P<0.05)。Kim等[27]研究了不同植物来源的淀粉酸解法制备的淀粉纳米颗粒的平均粒径，结果表明A型淀粉纳米晶的平均粒径会小于B型和C型淀粉纳米晶，且高直链玉米淀粉(B型)为原料制备的淀粉纳米晶平均粒径为69.7 nm。当硫酸浓度为4.0 mol/L酸水解5 d，莲子淀粉纳米晶的中值粒径D(50)为302 nm，莲子淀粉纳米晶粒径与A型、B型和其他C型淀粉纳米晶相比更大的原因在于莲子属于高直链特异性淀粉，直链淀粉抗酸解能力强。

2.3 分子质量分析

采用凝胶渗透色谱法测定的莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的分子质量大小如表2所示，分子质量分布图如图4和图5所示。莲子淀粉的重均分子质量(Mw)为5.25×106u，数均分子质量(Mn)为4.31×106u。与莲子淀粉相比，淀粉纳米晶的Mw和Mn降低了两个数量级，图5中莲子淀粉纳米晶的分子质量分布与图4中莲子淀粉相比明显向左偏移，说明酸水解后莲子淀粉颗粒分子结构遭到破坏，酸水解对莲子淀粉颗粒的作用是非特异性的，随机破坏淀粉无定形非晶区中直链淀粉和支链淀粉的糖苷键，导致分子质量降低[28]。多分散指数(Mw/Mn)表示分子质量分布范围，其数值越大表明分子质量分布范围越宽。莲子淀粉纳米晶的多分散指数均大于莲子淀粉，且硫酸浓度为4.0 mol/L酸水解5 d条件下制备的莲子淀粉纳米晶的多分散指数最大，这与图5所示的分子质量分布图的趋势结果一致，该结果也与莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的粒径分布结果相一致。

表2 莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的分子质量分布

图4 莲子淀粉分子质量分布

2.4 X-射线衍射图谱分析

采用广角X-射线衍射仪测定的莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的X-射线衍射图谱如图6所示。根据X-射线衍射图谱的特征峰位置可将淀粉结晶类型分为A型、B型、C型3种，A型结晶结构的特点是在衍射角2θ为15.00°和22.93°出现特征衍射峰并且衍射角2θ为17.02°和17.92°出现双峰，B型结晶结构的特点是在衍射角2θ为5.58°、15.13°、17.23°、19.67°、22.20°、24.00°和26.35°出现较强特征衍射峰，C型结晶结构的图谱是由A型图谱和B型图谱相结合而形成[29]。莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶在衍射角2θ为15.1°和23.1°处有特征衍射峰，且在衍射角2θ为17.1°和18.1°为双峰，在衍射角2θ为11.2°和26.4°处有弱峰，具有A型和B型的部分特征，表明莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶都为C型结晶结构，酸水解没有改变淀粉的结晶结构，这与Kim等[27]的研究结果一致。根据张本山等[23]的方法计算莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的相对结晶度，莲子淀粉的相对结晶度为34.94%，莲子淀粉纳米晶的相对结晶度均高于莲子淀粉，且制备条件为硫酸浓度4.0 mol/L酸水解5 d时，结晶度最高达到49.52%。此外，当硫酸浓度相同时，莲子淀粉纳米晶的相对结晶度随着酸水解时间的增加而增加；当水解时间相同时，硫酸浓度越高，莲子淀粉纳米晶的相对结晶度越大。莲子淀粉纳米晶的特征衍射峰均比莲子淀粉的特征衍射峰更尖锐，这是由于酸水解后淀粉的无定形区被破坏，留下了结构排列紧密的且不易被酸水解破坏的结晶区[30]，导致莲子淀粉纳米晶的相对结晶度增加。

图5 莲子淀粉纳米晶的分子质量分布

图6 莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的X-射线衍射图谱

2.5 红外光谱分析

根据红外光谱吸收峰宽度和强度的变化可以判断淀粉颗粒结构的变化。如图7所示莲子淀粉纳米晶具有相似的红外光谱图，表明酸水解没有破坏淀粉的主要结构，此结果与Zhou等[31]的研究结果一致。在淀粉红外光谱图中，1 045/1 022 cm-1的峰强度比值是衡量淀粉有序结构的指标，其比值越大，有序度越高[32]。莲子淀粉的1 045/1 022 cm-1峰强度比值为1.128，莲子淀粉纳米晶的1 045/1 022 cm-1峰强度比值均高于莲子淀粉，硫酸浓度4 mol/L酸水解5 d制备的莲子淀粉纳米晶的1 045/1 022 cm-1峰强度的比值最大，为1.361。酸水解后淀粉颗粒有序度增加的结果与莲子淀粉纳米晶相对结晶度结果相一致。此外，当硫酸浓度相同时，莲子淀粉纳米晶的1 045/1 022 cm-1峰强度比值随着酸水解时间的增加而增加；当水解时间相同时，硫酸浓度越高，莲子淀粉纳米晶的1 045/1 022 cm-1峰强度比值越大，该规律也与莲子淀粉纳米晶相对结晶度的规律相一致。

图7 莲子淀粉和莲子淀粉纳米晶的红外光谱图

3 结论

采用酸水解法制备莲子淀粉纳米晶，并对酸水解制备工艺中硫酸浓度和酸水解天数进行优化，研究结果表明，莲子淀粉纳米晶的最佳制备条件为：15 g莲子淀粉溶于100 mL 浓度为4 mol/L的硫酸中，在40 ℃的磁力搅拌水浴锅中以200 r/min的转速酸水解5 d。结晶结构为C型的淀粉为原料制备淀粉纳米晶与A型和B型淀粉为原料制备的淀粉纳米晶相同点在于结晶结构不会改变，没有生成新的官能团，结晶度都会随着酸水解时间的增加而提高；不同点在于淀粉纳米晶的颗粒形态和颗粒大小不同。本实验对莲子淀粉纳米晶的制备条件以及莲子淀粉纳米晶的结构特性进行研究，为莲子淀粉纳米晶理化及功能特性的进一步研究提供参考。