基于GC-MS评估不同预处理对小米代谢物提取的影响

田 翔， 薄 涛， 康 瑜， 刘 超， 乔治军

(山西农业大学农业基因资源研究中心1，太原 030031) (农业部黄土高原作物基因与种质创制重点实验室；杂粮种质资源发掘与遗传改良山西省重点实验室2，太原 030031) (山西大学生物技术研究所；山西大学杏花村学院；化学生物学与分子工程教育部重点实验室3，太原 030006) (山西农业大学山西功能食品研究院4，太原 030031)

小米是谷子籽粒脱皮后的种仁，含丰富的营养元素，如：碳水化合物、脂肪、蛋白质、维生素、微量元素以及矿物质，且易为人体消化吸收。与玉米、水稻和高粱相比，小米含有更多脂肪酸[1]。流行病学研究发现小米与降低心血管疾病、糖尿病以及某些癌症发生风险相关[2, 3]。从小米中能够提取出种类丰富、具有生物学活性和潜在药用价值的化合物，诸如具有抗菌活性以及抗氧化活性的酚类物质、黄酮类物质、木脂素、β-葡聚糖、酯醇、菊糖、色素、膳食纤维和植酸盐以及蛋白质等[1, 4-9]。小米还被认为是潜在的益生元食品，调节和保护人体肠道微生态平衡[1]。此外，小米可作为某些疾病患者的替代主食，例如：摄入富含麸质的食品可能导致由免疫系统引起的肠道疾病，而小米不含麸质，能够作为麸质敏感人群的替代食品[10]。

由于小米的营养价值和药用价值使其品种与产地越来越受到关注。不同品种与产地小米品质以及营养成分不尽相同[11-13]。因此，消费者在购买小米时其真实品种与产地就显得尤为重要。随着国际贸易增加，消费者对食品真实产地信息以及安全越来越重视[14]。欧洲自2000年9月已经要求将产地来源标注在农产品上[15]。使用地理标签亦能够使生产者获得市场认可。鉴于这一原因，新技术正在逐渐被要求用于确定食品产地与品种[16]。其中，非靶标代谢组学分析技术由于能够通过大规模数据获得对样品的全面认识而得到广泛应用[14]，诸如对蜂蜜、肉类、水果、茶叶、酒类、乳制品、坚果等多种食品代谢指纹图谱的分析，产地追溯以及品种鉴定[17-23]。然而，对小米代谢组学的相关分析还鲜见报道。

代谢组学分析首先需要对小分子代谢物进行提取，提取方法直接影响样品代谢物提取效率和分析结果[24, 25]。在动植物及微生物细胞代谢物提取时，样品破碎通常采用液氮研磨破碎，以保证代谢物提取过程在低温下进行，减少温度对提取代谢物的影响[24]。而植物性食品通常采用机械粉碎，例如：在对大米、咖啡豆代谢组学分析中利用机械磨将其粉碎成细小颗粒后提取[26, 27]。此外，食品代谢组分提取的方法有超声波提取和机械震荡提取等[28, 29]。不同提取方法对于同一对象的提取效果往往会存在差异[24]。为研究不同粉碎方式和提取方法对小米代谢物提取的影响，利用晋谷59号小米作为研究对象，基于GC-MS技术比较了机器粉碎与液氮研磨对小米小分子提取的影响，探讨了超声波提取、低温静置孵育、机械振荡及反复冻融等不同提取方案对小米小分子代谢物分析的影响。为小米等粟类农产品代谢指纹图谱分析、产地追溯以及品种鉴定等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

晋谷59号小米：2020年产于山西省忻州市，粒径均匀，颜色金黄，籽粒千粒重2.67 g，水分9.09 g/100 g，总淀粉75.01 g/100 g，脂肪3.10g/100 g，粗蛋白质12.13 g/100 g，纤维素2.62 g/100 g，灰分1.30 g/100 g，黄色素26.35 mg/kg。采样后冷冻干燥后放入-80 ℃冰箱保存。色谱级甲醇，吡啶、氘标记丁二酸(succinic acid,d4)、甲氧基胺盐酸盐(O-Methylhydroxylamine hydrocholoride)和N-甲基-N-(三甲基硅烷)三氟乙酰胺(MSTFA)、超纯水。

1.2 仪器与设备

Agilent 7890A-5795C气相色谱质谱联用仪，HP-5色谱柱， ALPHA 1-4 LD真空冷冻干燥机，Eppendorf 5430R冷冻离心机，Tissulyser Ⅱ高通量组织冷冻研磨仪，Cyclotec1093旋风磨，Millipore超纯水机，XMTB电热恒温水浴锅，QL-902旋涡混合器。

1.3 实验方法

1.3.1 小米代谢物提取

参考前人方法提取小米代谢物[30, 31]，每个样品进行3次平行重复。根据小米样品研磨破碎及代谢物提取方法不同分为4组。

方法1：通过液氮预冷的粉碎机粉碎30 s，重复两次获得小米粉；称取50 mg小米粉加入1 mL 50%甲醇提取液混合涡旋1 min；之后常温下以频率40 kHz、功率70%水浴超声提取5 min；

方法2：液氮冷冻条件下在研钵中研磨小米10 min；冷冻状态下称取50 mg小米粉，加入1 mL 40 ℃预冷的50%甲醇提取液混合涡旋1 min；通过组织研磨仪提取小分子代谢物，研磨90 s，2次，中间间歇90 s；

方法3：通过液氮预冷的粉碎机粉碎30 s，重复两次获得小米粉；称取50 mg小米粉加入1 mL 40 ℃预冷的50%甲醇提取液混合涡旋1 min，4 ℃ 12 h过夜浸提，之后通过液氮反复冻融5次提取小分子代谢物；

方法4：通过液氮预冷的粉碎机粉碎30 s，重复两次获得小米粉；称取50 mg小米粉加入1 mL 40 ℃预冷的50%甲醇提取液混合涡旋1 min，液氮冻融与组织研磨结合提取小分子代谢物，操作条件同方法2与方法3。

提取完成后12 000 r/min离心10 min收集上清液。取200 μL提取液，加入20 μL 内标溶液(氘标记琥珀酸1.6 mg/mL)，涡旋混匀，真空冷冻干燥机冻干。

1.3.2 样品衍生化

在GC-MS分析前，参考Bo等[31]方法对样品进行衍生化操作。

1.3.3 气相色谱质谱联用分析

主要色谱与质谱条件参考Bo等[31]。

1.3.4 代谢物定性定量方法

采用MSD 高效化学工作站软件(version E.02 01.1177)与AMDIS进行去卷积分析质谱峰。通过与美国国家标准与技术研究所(NIST 2011)质谱库匹配，对质谱峰进行定性。峰的归一化是通过所有峰面积与内标化合物氘标记琥珀酸的峰面积相比实现的，之后利用标准化后的峰面积进行数据处理。

1.3.5 数据分析

主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)：将归一化峰面积(变量)输入SIMCA软件(Simca-P 14，Umetrics，San Jose，Calif)分析。层次聚类分析(HCA)利用HCE(3.5 USA)软件进行层次聚类分析。通过R语言对数据进行清洗，R语言ggplot包与Origin2018对数据进行可视化呈现。

2 结果与分析

2.1 不同预处理方法对小米代谢物提取效果的影响

用4种不同预处理方法进行小米代谢物提取，基于GC-MS检测，4种处理组检测到的化合物峰信号分别为292、326、318和309。1、3、4处理组鉴定出57种小分子代谢物，处理组2相较于另外3种预处理方法少鉴定出3种代谢物，分别为天冬酰胺、葡萄糖内脂, 5-甲氧胺和赤藓糖醇。此外，2种未能定性的化合物在处理组2中也未能检出。造成这一结果的原因可能是粉碎方法不同。处理组2中采用液氮研磨粉碎，而另外3组采用机器粉碎。虽然方法2能够保证小米代谢物提取全程低温，有效降低了温度对代谢物的影响，但是其对小米的粉碎度不及机器。通过机器粉碎的小米粉末更为细腻，这可能使后续代谢物提取时小分子代谢物更容易被萃取。通过对不同处理组代谢物峰进行对数比分析发现不同处理组之间相比峰强度存在显著变异(如图1)。这些结果表明不同预处理处理方法对小米代谢物的提取结果具有显著影响。

2.2 小米不同预处理方法非靶标代谢组学结果的多元统计分析

为进一步分析不同预处理方法对小米小分子代谢物提取效率的影响，对4种不同预处理组的检出峰强度数据进行无监督主成分分析(PCA)、层次聚类分析以及有监督偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。在PCA和PLS-DA得分图中(图2和图3a)，4种不同处理组样本展现出明显的离散性，其中处理组2与另外3个处理组样本存在显著差异。层次聚类分析(HCA)结果也显示处理组2单独聚为一类，其他3种方法聚为一类(图4)，进一步证实了PCA和PLS-DA的分析结果。原因如前分析，粉碎小米方式会对小米代谢物提取产生显著影响。此外，PCA与PLS-DA得分图显示处理组3的平行样品更加离散，而处理组1和处理组4更加聚集，这表明处理组1和处理组4的重复性和稳定性更好；热图结果也表明小米不同预处理方法对不同种类代谢物萃取有不同的偏爱性。通过PLS-DA进一步分析能够找到造成不同处理组差异的10种标志代谢物，依次为蔗糖、硬脂酸、麦芽糖、葡萄糖胺、棕榈酸、丙三醇、葡萄糖、半乳糖、羟胺、1,2,3-丙三羧酸，这些标志代谢物的VIP值大于1(图3b)。处理组2对3种糖类Maltose、D-Glucose、D-Galactos以及Hydroxylamine的提取效率高于其他3个处理组(图5)。与处理组3和处理组4相比，处理组1中硬脂酸、麦芽糖、葡萄糖胺、葡萄糖、羟胺含量更高，除棕榈酸外，其他代谢物含量与处理组3和处理组4相似；因此，处理组1对10种标志代谢物的提取效果总体而言相较于处理组3、处理组4更好(图5)。处理组1与处理组3和处理组4在操作上的区别主要是对提取样品进行了超声波处理以及在代谢物萃取时全程常温进行，而处理组3和处理组4在低温下进行，亦没有进行超声波处理，这可能是造成提取结果差异的主要原因。在对人血清和绿豆种子小分子代谢物提取的过程中均发现超声波处理能够有效提升提取效率[25, 32]。在利用乙醇从粉粹的葡萄藤中固液萃取反式白藜芦醇，反式葡萄素、阿魏酸和总酚的研究中发现随着温度升高反式白藜芦醇，反式葡萄素和总酚的萃取效率显著提高[33]。在利用美洲无瓣紫檀种子和芦笋渣为原料固液萃取抗氧化化合物的研究中，可知在一定范围内提高温度能够显著提高萃取效率[34, 35]。这些研究结果与本研究结果相一致。

注：图中每个色点代表2个处理组峰强度均值比值的自然对数，其中红色色点代表2个处理组峰强度均值比值大于1，黑色色点代表2个处理组峰强度的比值等于1，绿色色点代表2个处理组峰强度的比值小于1。

注：置信区间为95%，在图中用椭圆表示。图2 不同预处理方法小米小分子代谢物主成分分析得分图

注：置信区间为95%，在图中用椭圆表示。图3 不同预处理方法小米代谢指纹偏最小二乘判别分析

图4 不同预处理方法小米代谢指纹层次聚类分析

图5 不同预处理小米差异代谢物相对含量比较

前人研究认为，在一定范围内温度升高能够通过提升传质效率与萃取物溶解度促进萃取物的提取[34, 36]。这一结论支持了本研究结果原因分析。

图6 小米不同类型代谢物相对含量比较

2.3 基于GC-MS的小米代谢指纹图谱分析

基于之前的结果分析，与预处理方法1相比，方法2提取代谢物种类较少，方法3重复性和稳定性较差，方法4对标志代谢物的提取效率较低。因此，预处理方法1是提取小米代谢物的最佳方案，对采用该方法的小米代谢指纹进行分析。通过GC-MS指认出的小米代谢物分为以下几类：氨基酸、糖、脂肪酸、有机酸、胺类、醇类、糖苷类以及其他。其中糖类和脂肪酸含量所占比例最大(图6)。对代谢物检出种类分析发现氨基酸检出10种、糖类9种、有机酸11种、脂肪酸和糖苷类化合物5种、胺类和醇类化合物6种、其他化合物12种。在之前的报道中，小米富含18种氨基酸[12]，而在本研究中检出10种氨基酸，这主要因为样品预处理方法不同。在之前的报道中，对小米氨基酸的分析首先需要将小米蛋白进行水解，得到游离氨基酸[12]。而本研究的目标是对小米进行非靶标代谢组学分析，直接通过固液萃取的方式提取小米小分子代谢物，并未对小米蛋白进行水解，因此检出氨基酸种类和相对含量与之前报道不同。对同类型代谢物相对含量进行分析，在检出的10种氨基酸中脯氨酸与N-乙酰赖氨酸相对含量最高，谷氨酸和天冬氨酸次之；糖类中蔗糖相对含量最高，半乳糖与葡萄糖次之，其他种类的糖含量相似；有机酸中1,2,3-丙三羧酸相对含量最高，丁二酸次之；脂肪酸中硬脂酸与棕榈酸相对含量较高；醇类中丙三醇含量最高；胺类Androst-2-En-17-Amine含量最高，葡萄糖胺次之；糖苷类Glycoside与吡喃葡萄糖苷相对含量较高。

本研究基于GC-MS从小米中共鉴定出57种小分子代谢物，与其他食品基于GC-MS鉴定出的代谢物数量相似(图7)，例如在红小豆(Adzuki bean)、大米种子(Riceseed)以及天培(Tempe)中分别鉴定出56、48、58种小分子代谢物[14, 30, 37]。比较上述报道检出和鉴定出的代谢物种类数，本研究对小米小分子代谢物的提取效率良好。将从这4种食品中鉴定出的代谢物种类进行比较，共有代谢物是三种氨基酸，天冬酰胺、谷氨酸和脯氨酸。小米独有代谢物有38种。小米单独与红小豆、大米种子以及天培相比，小米独有代谢物数量分别为44、48和49种。基于GC-MS检测平台，不同食品样品鉴定出的代谢物种类存在较大差异。这一结果表明不同食品的代谢指纹显著不同，同时也表明基于GC-MS的非靶标代谢指纹分析是鉴定食品代谢指纹的有效手段。

图7 基于GC-MS代谢组学分析不同食品代谢物种类比较

3 结论

本研究采用基于GC-MS的代谢组学技术评估了不同预处理方法对小米代谢物分析的影响，结果发现不同预处理方法对于小米代谢物提取的覆盖度和信号强度有显著影响；通过机器粉碎小米的处理组1、处理组3和处理组4对代谢物提取效果要优于手动液氮研磨的处理组2；在后续代谢物固液萃取中处理组1提取代谢物的稳定性和信号强度要好于处理组3和处理组4。因此，处理组1为小米小分子代谢物提取的最优方案。利用该方案，基于GC-MS的代谢组学技术鉴定出包括氨基酸、糖类、有机酸、脂肪酸、醇类、胺类、糖苷类7类小分子代谢物，共计57种。本研究为小米等粟类农产品代谢指纹图谱分析、产地追溯以及品种鉴定等提供了方法与数据参考。