糖基化改性对英国红芸豆抗氧化肽抗氧化活性的影响

赵玉滨， 穆秋霞， 董宪慧， 郑喜群，王 坤， 崔素萍

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319) (国家杂粮工程技术研究中心2，大庆 163319) (粮食副产物加工与利用教育部工程研究中心3，大庆 163319)

抗氧化肽是一类生物体内源或由动植物蛋白质水解后生成的，具有清除自由基、抑制脂质过氧化作用的活性寡肽或多肽。抗氧化肽作为一种天然抗氧化剂，其结构相对简单，具有易吸收、稳定性好、无免疫反应性等优点，在食品和医疗保健品领域备受关注[1]，可作为食品添加剂减缓食品在储藏过程中的氧化反应[2]。乔晓林等[3]通过酶解小麦面筋蛋白，利用超滤膜对小麦面筋蛋白酶解物进一步分离、纯化，获得了具有很强的体外抗氧化活性多肽组分。

目前，抗氧化肽的抗氧化活性仍然远不如人工合成的抗氧化剂活性高，因此，提高天然抗氧化肽活性的改性方法是目前的研究热点之一[4]。常用的改性方法有化学改性、酶法改性和基因工程改性等。化学改性方法包括糖基化、磷酸化、酰化、脱酰胺、共价交联、水解及氧化等法；其中糖基化改性是一种非酶促褐变反应，是基于美拉德反应机理的羰氨缩合反应，该过程不需任何化学催化剂参与即可完成[5]，糖基化改性有助于增加抗氧化能力和抗菌能力等[6]。抗氧化肽通过糖基化改性后抗氧化活性会得到大幅提升，这些研究使人们对抗氧化肽的生物活性有了新的认识。研究表明，糖基化改性不但可以有效提高天然蛋白质及肽的抗氧化活性，而且具有低毒、高效等优点[7]。林巍等[8]利用 3 种糖与紫花芸豆肽发生糖基化反应，反应产物的 ATBS 自由基清除率及 DPPH 自由基清除率也显著增加。但目前有关糖基化改性反应温度过高(高于 100 ℃)，易生成有害物质，杜卿卿等[9]利用木糖和半胱氨酸在 110 ℃ 下发生糖基化反应，产物中含有呋喃、杂环胺等有害物质。邵艳红[10]在对牛血清蛋白进行糖基化改性时也发现改性产物中由类黑精、果糖胺等有害物质的生成；所以如何更好地利用湿法糖基化改性在提高目标物抗氧化活性的同时，又能保证产生较少的有害物质是需要进一步研究的课题。

英国红芸豆是豆科菜豆属的一种杂粮作物，芸豆品种最早引自英国，外观呈紫红色，肾型，该品种是近年来在国内外市场非常畅销的芸豆品种[11]。我国主要在东北、内蒙古、陕西、河北等地区种植[12]，其中黑龙江省是英国红芸豆的主要产区，占全年英国红芸豆出口总量的1/4左右[13]。韩晶等[14]在对黑龙江 6 个主要种植品种的芸豆进行营养素评价研究发现，在对En、紫荆花、白沙克、日本红、西班牙白、英国红等 6 个品种进行蛋白质含量测定后得到结论，英国红芸豆的蛋白质质量分数达到 22.03%，是6个芸豆品种中蛋白质含量最高的。

本课题组前期制备了英国红芸豆蛋白抗氧化肽，为了进一步提高其抗氧化活性，拟对其进行糖基化改性，同时为了减少糖基化改性产物中有害物质丙烯酰胺的生成，将改性温度控制在 90 ℃。以抗氧化肽冻干粉为原料，运用湿法糖基化改性的方法，使芸豆抗氧化肽与木糖进行糖基化反应，以羟自由基清除率和丙烯酰胺生成量为指标，确定糖基化改性最佳反应条件；然后分析糖基化改性产物的抗氧化情况、褐变程度和接枝度；最后通过荧光光谱法、紫外光谱法、傅里叶红外光谱法、SDS-聚丙烯酰氨凝胶电泳和粒径分布测定，对糖基化改性产物进行分析，以期为英国红芸豆抗氧化肽糖基化改性产物的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

英国红芸豆；碱性蛋白酶(2709，2.0×105U/g)、还原型谷胱甘肽，为生化试剂。木糖、果糖、葡萄糖等其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

日立 U-2910 型紫外分光光度计，Chrwasta Epsilon 2-4 D 型冷冻干燥机， CF16 RN 型超速离心机，RF-6000 型荧光光谱仪，Tensor 27 型傅里叶变换红外光谱仪。

1.3 方法

1.3.1 英国红芸豆抗氧化肽的制备

参照参考文献[15]的方法，利用碱性蛋白酶制备英国红芸豆蛋白抗氧化肽，真空冷冻干燥备用。

1.3.2 抗氧化肽糖基化改性最佳还原糖的确定

分别称取 0.1 g糖(木糖、果糖、葡萄糖)和 0.1 g英国红芸豆抗氧化肽，加入 10 mL水充分溶解，调节 pH 7，进行 10 min 紫外线杀菌。反应温度为 90 ℃，反应时间 4 h，以相同浓度的VC溶液作对照，以糖基化产物羟自由基(·OH)清除率为指标，确定最佳还原糖，羟自由基清除率的测定方法见参照文献[16]。

1.3.3 糖基化改性最佳反应条件的优化

丙烯酰胺测定方法见参照文献[17]，丙烯酰胺标准曲线线性回归方程为：y=-6×10-5c+0.316 9，回归系数R2=0.991 6。其中c为丙烯酰胺浓度，y为吸光度(A)。将 1.3.2 中确定的最佳还原糖用于后续糖基化改性，改性温度控制在 90 ℃，分别对 pH(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)，反应时间(2、3、4、5、6 h)和糖肽比为(0.5∶1，1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5 ∶1、1∶1.5、1∶2.5)等进行单因素实验，以糖基化产物的羟基自由基清除率和丙烯酰胺含量为指标，确定正交实验因素的最优水平后，进行正交实验和验证实验，最终确定糖基化改性的最优反应条件。

1.3.4 抗氧化肽糖基化改性前后体外抗氧化活性分析

参照参考文献[16]的方法对糖基化产物进行羟自由基清除率、DPPH 自由基清除率、亚铁离子螯合能力及还原力的分析。

1.3.5 糖基化改性褐变程度分析

褐变程度测定方法见文献[18]，稍有改动，分别取2.0 mL质量浓度为 10 mg/mL 的糖基化反应前后的溶液加入 8.0 mL 稀释液(质量分数10%SDS 及 0.05 mol/L 硼砂)，在 420 nm 下测量糖基化反应前后的吸光度，以稀释液作空白。

1.3.6 糖基化改性接枝度的测定

参照参考文献[19]的方法，用游离氨基酸含量表征产物的接枝度(DG%)。测定时将糖基化改性前后的溶液分别稀释至 2 mg/mL，运用 OPA 法测定接枝度(DG)。

1.3.7 荧光光谱分析

利用 pH 7.2 的磷酸缓冲液，分别配制浓度均为 5 mg/mL 的芸豆蛋白抗氧化肽和糖基化反应产物的待测液。取 20 μL ANS溶液(8 mmol/L)加到 4 mL 待测液中混合均匀，在激发波长为 347 nm 处激发，激发带宽 5 nm，扫描速率为 100 nm/min，迅速进行 365～550 nm 波长扫描，以未加样品的磷酸盐缓冲液为空白。

1.3.8 紫外-可见光谱分析

将质量浓度为 2 mg/mL 的英国红芸豆抗氧化肽和糖基化反应产物用紫外可见分光光度计从 245 nm 扫描到 400 nm，比较反应前后样品的紫外吸收特性的变化。

1.3.9 傅里叶中红外光谱分析

将 2 mg 糖基化改性前后的冻干样品分别与 200 mg溴化钾粉末充分混合研磨，在 10～12 T 压力下将混合粉末压制成固体薄膜，进行全波段扫描，测量范围为4 000～400 cm-1。

1.3.10 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

实验使用 5% 的丙烯酰胺浓缩胶和质量分数16.5%丙烯酰胺分离凝胶进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，制备 pH 8.0 的样品缓冲液。将 200 μL 浓度为 40 mg/mL 样品溶液与 200 μL 的 1×SDS 负载缓冲液混合，置于沸水中 5 min。冷却后，将 Marker、芸豆抗氧化肽、糖基化改性产物以及英国红芸豆蛋白溶液样品分别取 18 μL 注入斑点井。将浓缩凝胶中的电压设置为 60 V，分离凝胶电压设置为 110 V 进行电泳。当溴酚蓝离凝胶底部约 1 cm 时，电泳终止，通过凝胶成像仪进行观察。

1.3.11 粒径分布测定

分别用去离子水配制 1 mg/mL 的抗氧化肽和糖基化改性产物溶液，采用 ZEN-3700 型马尔文激光粒度仪对溶液的平均粒径进行测定。实验时测定时间设为 120 s，选用 DTS0012 皿在室温条件(25 ℃)下重复测定 20 次。

1.3.12 数据统计分析

用 Origin 8.5 和 SPSS 26.0 软件进行统计和方差分析(ANOVA)，用 Duncan 法进行差异显著性分析，所有实验均做3次重复，取平均值。

2 结果与分析

2.1 最佳还原糖的确定

由表1可见，木糖与抗氧化肽糖基化反应产物的羟自由基清除率为 66.4%，显著高于(P<0.05)葡萄糖和果糖，但显著低于同等质量浓度(10 mg/mL)下VC的活性，结果与孙炜炜等[20]在进行赖氨酸糖基化改性研究的结果一致。由于木糖是一种五碳糖，与葡萄糖和果糖相比，更容易发生糖基化反应。因此，选择木糖作为英国红芸豆抗氧化肽糖基化改性的目标糖。

表1 单糖种类对糖基化产物羟自由基清除率的影响

表2 pH 对糖基化反应产物羟自由基清除率和丙烯酰胺含量的影响

表3 反应时间对糖基化反应产物羟自由基清除率和丙烯酰胺含量的影响

表4 糖肽比对糖基化反应产物羟自由基清除率和丙烯酰胺含量的影响

2.2 糖基化改性条件优化

2.2.1 最佳 pH 的确定

如表2所示，当pH 7.0时，糖基化反应产物的羟自由基清除率最高为 71.1%，且差异显著(P<0.05)，但显著低于VC的清除能力。碱性条件下生成的丙烯酰胺量显著低于酸性条件下的生成量，当 pH 为8.0时，丙烯酰胺含量均最低。由于pH为8.0时反应产物的羟自由基清除能力显著低于pH 7.0，不利于提高改性产物的抗氧化活性。综合考虑抗氧化活性及丙烯酰胺生成量，初步确定pH 7.0为糖基化改性最佳pH。郭浩等[21]在研究葡萄糖糖基化改性玉米醇溶蛋白膜的物化性质时，选用的最佳pH也是7.0。

2.2.2 最佳反应时间的确定

如表3所示，反应时间为4 h时，反应产物的羟自由基清除率最高为69.3%，且差异显著(P<0.05)，但显著低于VC的清除率。随着反应时间的延长，丙烯酰胺含量显著增加，反应时间为2、3 h时，丙烯酰胺含量较低。综合考虑改性产物的抗氧化活性及丙烯酰胺的生成量，确定糖基化改性最佳反应时间为4 h，这与赵玉滨等[22]在研究糖基化改性对酪蛋白酶解产物抗氧化性影响时所选的最佳反应时间一致。

2.2.3 最佳糖肽比的确定

如表4所示，在糖肽比为 1∶1 时，反应产物的羟自由基清除率为 72.8%，显著(P<0.05)高于其他各组，但显著低于 VC的清除率。在糖肽比为 1∶1.5 和 1.5∶1 时，羟自由基清除率也较高，说明糖肽比例越接近于 1∶1，反应产物的羟自由基清除率就会越高，相应的抗氧化性也会越强。当糖肽比为 1∶1 时，丙烯酰胺含量最低，为 279.50 μg/L，且差异显著(P<0.05)；在糖肽比为 1.5∶1 时的丙烯酰胺生成量显著低于 1∶1.5 的丙烯酰胺含量。可见，反应体系中越丙烯酰胺的含量随着木糖的含量增加而增加。当肽糖比例控制在 1∶1 时，反应产物的羟自由基清除率最大且丙烯酰胺含量最低。张亚婷等[23]在研究复合物改性大豆分离蛋白功能性质时，也利用了糖基化改性提高抗氧化性，得出的最佳糖肽比也为 1∶1。

2.2.4 正交实验及结果

在单因素实验的基础上，设计正交实验，正交实验因素水平见表 5，实验结果见表 6。K(k) 代表羟基自由基清除率，K’(k’)代表丙烯酰胺含量。在糖基化温度为 90 ℃，影响改性产物羟自由基清除率的主次因素为：A>C>B，pH 为主要影响因素；影响丙烯酰胺生成量的主次因素为：B>C>A，时间为主要因素。羟自由基清除率和丙烯酰胺生成量的最优水平分别为A2B1C1(pH 7、反应时间 3.5 h、糖肽比 1∶1.25)和A2B2C2(pH 7、反应时间 4 h、糖肽比 1∶1)，反应温度均为 90 ℃。

表5 正交实验因素水平表

表6 正交实验结果分析

续表6

2.2.5 验证实验

将2个最优水平组合设计验证实验，进行3次平行实验。验证结果表明，A2B1C1的羟自由基清除率为 67.5%，丙烯酰胺生成量为342.66 μg/L；A2B2C2的羟自由基清除率为 77.2%，丙烯酰胺生成量为 359.23 μg/L，我国行业标准要求一般食物或食物原料中最大检测限为 0.2 mg/kg(干基含量)，在动物可食性组织中的检测限为 0.05 pg/g，本实验研究结果与我国丙烯酰胺行业检出标准接近。其中A2B2C2条件下制备糖基化改性产物的羟自由基清除率显著高于A2B1C1；两种条件改性产物中丙烯酰胺生成量较低且无显著性差异，所以A2B2C2为英国红芸豆抗氧化肽糖基化改性的最佳反应条件，即 pH 7、时间 4 h、糖肽比例 1∶1，反应温度为90 ℃。

糖基化改性可以显著提高英国红芸豆抗氧化肽的抗氧化活性，最优的糖基化改性条件为：反应体系 10 mg/mL、反应温度 90 ℃、pH 7、反应时间 4 h、反应体系糖肽比为 1∶1。

2.3 糖基化改性前后体外抗氧化活性分析

由表7可见，与改性前相比，改性后羟基自由基清除率、DPPH 自由基清除率、还原力分别提高了80.9%、75.1% 及 135.7%，但均显著低于同等浓度 VC的抗氧化能力；改性前后与亚铁离子螯合能力均显著高于 VC，这与 Li等[24]的研究结果一致，改性后的芸豆抗氧化肽与亚铁离子的螯合能力提高到了 60.4%。抗氧化剂的抗氧化机理有自由基清除剂、单线态氧淬灭剂、氢过氧化物转化剂、金属螯合剂等。刘祥等[25]在研究糖基化对玉米蛋白粉双酶水解产物抗氧化活性的影响时发现，糖基化产物羟基自由基清除率、DPPH 自由基清除率、还原力、与亚铁离子螯合能力均得到显著提高。江连洲等[26]在研究葡聚糖糖基化处理对绿豆蛋白抗氧化性影响研究时也发现，绿豆蛋白还原力、DPPH 自由基清除能力、超氧阴离子自由基、羟自由基清除能力都有显著提高。可见，糖基化改性是提高英国红芸豆抗氧肽组分抗氧化性的一种非常高效的方法。

表7 糖基化改性前后抗氧化活性的变化

2.4 褐变程度分析

糖基化产物褐变程度及接枝度见表8。通过糖基化改性反应，改性产物的褐变程度达到了0.52；改性后产物的接枝度为 39%，改性前接枝度 2%，说明抗氧化肽中氨基酸与木糖进行了充分的羰氨缩合反应，生成了分子量较大的物质如类黑色素类，导致吸光度上升，反映出褐变程度加深。刘郁琪等[22]在研究酪蛋白与可溶性大豆多糖糖基化产物制备时，接枝度也达到 20.7%，与本研究相符。反应后的产物接枝度增大，说明反应体系游离氨基含量减少。

表8 糖基化改性前后褐变程度及接枝度改变情况

2.5 荧光光谱分析

如图1所示，荧光物质是糖基化反应进行到末期阶段生成的产物，是糖基化改性反应的一个显著特征[27]。伴随糖基化改性的发生，反应产物中生成大量的有色物质[28]。反应前的抗氧化肽最大吸收峰在413 nm附近，最大荧光强度为3 761，而改性后的反应产物最大吸收峰在419 nm附近,最大荧光吸收强度达到了12 806.6，荧光吸收特性显著增强，这符合糖基化产物所具有的荧光特性。有研究报道在葡萄糖和赖氨酸体系中荧光物质的积累是由于还原物质与胺之间不可逆转的反应[29]，大多数荧光化合物的形成是与存在酪蛋白以及褐变的发生相关联的，证明了芸豆蛋白肽和木糖发生了共价接枝反应。

图1 荧光吸收光谱

2.6 紫外吸收光谱分析

如图2所示，糖基化改性产物紫外光吸收的最大吸收峰都出现在265～275 nm内，在此范围内有较大的吸收峰的应该是抗氧化组分中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸所致，若此3种氨基酸发生反应，反应产物在265～275 nm处紫外吸收强度应该降低，但是糖基化产物的吸收峰强度较芸豆抗氧化肽相比反而明显增强，并且反应产物的最大吸收峰向左偏移发生了蓝移现象，这可能是由于糖基化改性反应过程中，产生了较多的具有紫外光吸收特性的物质[24]，所以导致糖基化改性产物在此处紫外吸收强度增大。

图2 紫外吸收光谱

2.7 傅里叶中红外光谱分析

图3 傅里叶中红外光谱

2.8 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

如图4所示，第1泳道的芸豆蛋白抗氧化肽未出现明显条带，说明芸豆蛋白经碱性蛋白酶酶解后生成的多肽种类较多，多肽的分子量大小大多集中在20 ku处左右，与最右侧第 3 泳道的芸豆蛋白相比，分子量明显减小，表明碱性蛋白酶对芸豆蛋白酶解比较彻底。分子量明显经过糖基化改性反应以后生成第2泳道的糖基化改性产物颜色变浅，可能是芸豆抗氧化肽经过糖基化反应后，自由氨基减少，染色剂考马斯亮蓝与糖基化改性产物反应位点减少，进而减少了考马斯亮蓝与多肽的结合，导致考马斯亮蓝染色时颜色变浅，这也间接证明了经过糖基化改性生成了新的物质[32]。

注：M为蛋白肽Marker；1为芸豆抗氧化肽；2为糖基化改性产物；3为芸豆蛋白。图4 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图

2.9 粒径分布测定

如图5所示，反应前抗氧化肽的粒径分布在400～1 100 nm之间，经过糖基化改性生成的糖基化改性性产物的粒径分布在100～300 nm之间，糖基化改性产物的粒径减小，这与于枫[33]在研究米糠蛋白糖基化改性产物粒径的变化趋势一致；粒径减小的原因可能是芸豆抗氧化肽经过糖基化改性反应后，由于木糖的接入，使得抗氧化肽的结构发生了变化，抗氧化肽溶液中原有的聚集颗粒被破坏分散，形成粒径更小的均一体系。粒径对抗氧化肽乳液的稳定性十分关键，较小的粒径导致界面张力下降，提高了乳液抵抗失稳的能力，同时粒径越小乳液越不容易分层，相应的乳液中的聚集现象越少，这增加了分子内部疏水基团发挥作用的机会，表明芸豆抗氧化肽糖基化改性产物作为乳化剂具有很好的应用潜力。

图5 粒径分析图

3 结论