乳化大豆油与乳化猪油对肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶的影响

欧阳园园， 郑 志

(合肥工业大学，合肥 230601)

火腿、香肠等肉糜制品中维持结构的蛋白质主要是肌原纤维蛋白(myofibrillar protein, MP)，其对产品的口感、组织结构具有重要作用，并且具有良好的与水结合的能力及与脂肪颗粒结合的能力[1, 2]。在肉糜制品生产加工过程中，会添加一定量的植物蛋白，如小麦面筋蛋白(WG)，来提高产品蛋白含量，增强肉糜制品的口感[3-5]。

传统肉糜制品会添加较高含量的动物脂肪，具有优良的风味、口感，受到许多消费者青睐[6,7]。但动物脂肪含量较高在生产过程中，容易出现产品组织粗劣，硬度差、弹性低以及出油等问题，影响产品质量[8]。一些研究尝试在香肠、肉丸等产品中添加植物油，希望改善口感和质地[9,10]。有研究发现直接将植物油加入肉糜中，油脂的氧化性会增加，影响凝胶的持水性和质构，凝胶网络结构变得疏松，油脂也容易聚集发生崩塌现象[11, 12]。脂肪的预乳化是以大豆蛋白、面筋蛋白或肌原纤维蛋白自身作为乳化剂预乳化脂肪，脂肪在高速剪切作用下会形成小分子的脂肪球膜蛋白，依靠共价或非共价作用与连续相蛋白基质相交联[13]。马龙彪[14]发现将乳化的植物油添加到鹿肉香肠中，可获得较好的香肠口感。Liu等[15]发现预乳化的花生油可以提高鱼糜凝胶的白度和持水性，并通过增大油滴的表面积增强凝胶体系的稳定性。目前，通过直接添加植物油来改善肉糜制品的品质的研究有较多报道，而添加预乳化处理的植物油和猪油对肉糜蛋白凝胶的机理研究还有待于扩展和深化。

本研究选用肌原纤维蛋白/面筋蛋白作为研究的对象，探讨预乳化猪油和预乳化大豆油对肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶的质构、持水性能、蛋白二级结构的影响，并且进一步明确脂肪在预乳化作用下与蛋白的相互作用及稳定机制，为促进植物脂肪代替动物脂肪，开发高附加值、更健康的肉产品提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦面筋蛋白(蛋白质量分数为80%)、TG酶(1 000 U/g)、猪里脊肉、猪板油。

1.2 仪器与设备

10N-50A低温冷冻干燥机，TA-XT Plus 质构仪，FJ300-SH 高速剪切乳化机，DSC-500B 差示扫描量热仪，Frontier傅里叶红外光谱仪。

1.3 方法

1.3.1 凝胶制备

1.3.1.1 肌原纤维蛋白的提取

根据Wang等[16]的方法稍作修改，所有步骤均在2～4 ℃下进行。将切好的肉糜分散在4倍体积的缓冲液(0.1 mol NaCl，10 mmol磷酸钠，2 mmol MgCl2，1 mmol EDTA，pH 7.0)中，用搅拌器高速匀浆60 s，转速4 000 r/min离心15 min，弃去上层清液。将沉淀溶解在上述的磷酸盐分离缓冲液中，匀浆60 s后，转速4 000 r/min离心15 min，同样的步骤重复3次。将得到的沉淀置于4倍体积的0.1 mol NaCl缓冲液中，重复3次相同的离心、匀浆、洗涤处理。沉淀即为肌原纤维蛋白，备用。

1.3.1.2 预乳化液的制备

根据Wu等[17]方法，猪板油切成1 cm×1 cm×1 cm的方块，100 ℃加热至液体油脂析出，降至室温后，纱布过滤2次，备用。在60 mL 10 mg/mL的肌原纤维蛋白溶液中加入40 mL猪油，高速剪切机16 000 r/min下剪切2 min，30 s 1次，分4次完成，得到预乳化猪油。同样的操作过程，得到预乳化大豆油。

1.3.1.3 复合凝胶制备

参照前人方法并做调整[18,19]，将1.6 g的面筋蛋白添加到 50 mL 50 mg/mL的肌原纤维蛋白溶液中制成蛋白分散液。将制得的大豆油与猪油乳化液分别与蛋白分散液混合均匀，得到含有0、5%、10%、15%、20%脂肪的蛋白分散液。每组分散液中都加入90 U/g的TGase，用保鲜膜封口，45 ℃保温2 h，然后放入90 ℃水浴中加热10 min，取出冰水浴至室温，并冷藏24 h，待测。

1.3.2 凝胶性能测定

1.3.2.1 质构测定

根据Wang等[20]方法，将凝胶切成2 cm×2 cm×2 cm的方块，采用物性仪测定凝胶的质构。选择P/36R的探头，调整测试前、后速度为2 mm/s、测试速度为1 mm/s，接触的触发力为5 g，凝胶压缩的距离为10 mm。控制两次测定的时间间隔为5 s。

1.3.2.2 持水含量测定

在Wang等[21]方法上略微调整。取3 g凝胶样品于10 mL离心管中，5 000 r/min条件下离心20 min，滤纸吸去水分，计算得出失去水分的质量mr。将离心后的凝胶样品置于小烧杯中，置于120 ℃的烘箱中，烘至恒重，计算得出凝胶中总含水量mt。

式中：mr为肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶离心前、后失去的水分质量/g；mt为凝胶中总含水量/g。

1.3.2.3 可冻结水与非冻结水测定

根据Li等[22]方法测定可冻结水与非冻结水的含量，稍作修改。称取10～15 mg凝胶样品置于固体铝锅中，密封。将样品坩埚置于传感器上，空铝锅为空白对照，控制氮气流速稳定为50 mL/min，以5 ℃/min的速度将温度从-50 ℃升温至20 ℃。根据每克样品在0 ℃时的熔融焓与纯水的熔融焓(334 J/g)比值，计算可冻结水(mf)的含量。非冻结水(mnf)由公式确定。

mnf=mt-mf

式中：mt为相同质量凝胶样品用烘干法测得的总含水量。

1.3.3 分子间作用力测定

采用Gómez - Guillén等[23]和Qin等[24]方法，略有改动。取0.1 g冻干后的肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶样品于10 mL的离心管中，每个离心管中都加入5 mL缓冲液，摇匀后静置1 h，保证充分反应，转速8 000 r/min离心20 min，测定上清蛋白含量。缓冲液为：A液(0.05 mol NaCl的溶液)；B液(0.6 mol NaCl的溶液)；C液(0.6 mol氯化钠的溶液+1.5 mol的脲素)；D液(0.6 mol氯化钠的溶液+8 mol的脲素)；E液(0.6 mol NaCl+8 mol的脲素+0.5 mol/L β-巯基乙醇)，缓冲液均用0.05 mol的磷酸缓冲溶液为溶剂。其中缓冲液A和B的蛋白含量之间的差异表示离子键的作用，缓冲液B和C的蛋白含量差异表明氢键作用，缓冲液C与D蛋白含量差异表明疏水相互作用，缓冲液D与E蛋白含量差异表明二硫键的作用。

1.3.4 FTIR的测定蛋白二级结构

采用吴晓娟等[25]方法，冷冻干燥的凝胶与溴化钾研磨，压片。FTIR进行扫描，扫描的波段范围为4 000～400 cm-1，扫描的次数为32次。用软件Omnic 8.0对酰胺I带1 600～1 700 cm-1波段的图谱进行分析，校正基线、去卷积以及二阶导数拟合。根据峰面积计算二级结构相对含量。

1.4 数据统计分析

实验操作至少重复6次，以平均值表示结果。使用软件Origin 8．0软件和SPSS对数据进行拟合和显著性分析(P<0.05 )。

2 结果与分析

2.1 质构分析

乳化大豆油与乳化猪油对凝胶咀嚼性、弹性、硬度和胶黏性的影响，如表1所示。添加了0%～20%乳化猪油与乳化大豆油对肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶的硬度、弹性、咀嚼性和胶黏性都显著性提高(P<0.05)，且添加大豆油的样品指标都略优于添加猪油的样品。硬度、弹性的提高是由于高剪切作用使脂肪颗粒体积变小，易于进入蛋白凝胶网络的细小空隙，促使凝胶网络更加致密；且有报道油脂与蛋白进行预乳化后，有助于盐溶性蛋白形成凝胶结构，改善的凝胶结构[26]。

表1 乳化大豆油和乳化猪油添加量对MP/WG凝胶硬度、弹性、咀嚼性、胶黏性的影响

2.2 持水性分析

凝胶的持水性是凝胶另一重要指标，持水性是决定凝胶稳定性的重要参数，反映了凝胶三维网状结构截留水分的能力，高的持水性表明凝胶内部水分结合牢固，加热过程中水分不易流失。乳化大豆油与乳化猪油对肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶持水性的影响，如图1所示。对比添加乳化猪油和乳化大豆油的实验组发现，两组之间持水性没有出现明显差异，然而添加脂肪的肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶的持水性能比空白对照凝胶明显提高(P<0.05)。持水性的增加是因为蛋白质与脂质分子在高速剪切作用下，分散成较小颗粒，被束缚在致密的凝胶网络结构。Wu等[17]在研究中得出，脂肪表面膜蛋白和肌原纤维蛋白的相互作用可以提高凝胶网络的保水能力。

图1 乳化大豆油和乳化猪油添加量对MP/WG凝胶的持水性的影响

2.3 可冻结水与非冻结水分析

差示扫描量热法可以用来分析蛋白凝胶中水分的存在状态，水分的存在状态会影响凝胶的持水性[27]。图2是不同脂肪添加量(乳化大豆油和乳化猪油)的肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶DSC曲线图，计算得出肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶中的可冻结水和非可冻结水含量，如表2所示。由图2可知，肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶随着乳化大豆油和乳化猪油添加量的增加吸热峰逐渐向低温段移动，从3 ℃(未添加油脂)逐渐降低到0 ℃以下。

图2 不同乳化油添加量的MP/WG凝胶的DSC图

由表2可知，随着脂肪添加量的增加，凝胶中可冻结水的含量逐渐降低，而非可冻结水的含量逐渐增加(P<0.05)。非可冻结水指在-40～25 ℃范围内没有发生相变，依然与蛋白质、油脂等其他物质结合的水[27]，其含量的增加表明复合凝胶随着油脂添加量的增加，体系中紧密结合的水含量也在增加，具体表现为肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶的持水性增加。

表2 乳化大豆油和乳化猪油添加量对MP/WG凝胶的水分状态的影响/%

2.4 分子间作用力分析

乳化大豆油与乳化猪油对肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶分子间作用力的影响，如图3所示。肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶中的相互作用力主要为非共价作用和共价作用，共价作用包括TGase介导异肽键和二硫键，非共价有包括离子键、氢键和疏水相互作用。由图3可知，随乳化油脂添加量的增加，维持肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶结构的作用力主要是二硫键，与添加乳化猪油的凝胶相比，添加乳化大豆油的凝胶维持凝胶结构的相互作用还包括疏水相互作用和氢键。高速剪切作用形成的小分子油脂颗粒，与蛋白接触表面积增大，利于氢键、二硫键的形成，促进网络空间结构的稳定，外在表现为乳化稳定性及持水性的增加[5,19]。这也进一步解释复合凝胶持水性能增加的原因。离子键作用减小可能是由于疏水相互作用及氢键的增加改变了蛋白的空间结构，更多的疏水基团暴露出来，从而改变了蛋白的电荷，导致形成的离子键减少。

图3 乳化大豆油和乳化猪油添加量对MP/WG凝胶中分子间作用力的影响

2.5 蛋白二级结构含量的分析

图4是不同乳化大豆油和乳化猪油添加量的肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶红外谱图。由图4可知，随着乳化大豆油添加量的增加，肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶酰胺Ⅰ带的峰逐渐向右偏移，酰胺Ⅲ带(1 230～1 350 cm-1)的峰强逐渐增加。通过Omnic 8.0对红外图谱的酰胺I带进行分析，凝胶中蛋白二级结构含量如表3所示，不同添加量乳化大豆油与乳化猪油的肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶的各二级结构含量发生显著变化。乳化大豆油与乳化猪油添加量的增加对蛋白质的二级结构产生相似的影响，表现为α-螺旋结构逐渐转变为β-折叠和β-转角，Herrero等[28]和Shao等[29]也得出相似研究结果。有报道表明酰胺Ⅲ带的峰强的增加β-折叠结构的含量有一定关系[30]。β-折叠含量的提高利于产品硬度的增加，赋予产品更好的质构[31]，这也从另一方面解释了凝胶的硬度、弹性、咀嚼性增加。

图4 不同乳化大豆油添加量的MP/WG凝胶红外谱图

表3 酰胺Ⅰ带估算不同乳化大豆油和乳化猪油添加量的MP/WG凝胶蛋白二级结构含量

3 结论

大豆油与猪油的预乳化处理能够显著改善添加脂肪的肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶性能。随着乳化大豆油和乳化猪油添加量的增加，凝胶的硬度，弹性、咀嚼性、持水性等均显著升高，维持蛋白质、脂肪颗粒及水分子间的主要相互作用力为二硫键；蛋白二级结构发生改变由α-螺旋逐渐转化为β-折叠和β-转角。当乳化脂肪添加量大于15%时，凝胶的硬度、咀嚼性仍呈增高趋势，持水性、弹性无明显增加。添加同比例的大豆油与猪油时，添加乳化大豆油的肌原纤维蛋白/面筋蛋白凝胶的弹性、咀嚼性以及硬度等质构较优于添加乳化猪油的凝胶而持水性上没有显著增加。