紫苏籽粕蛋白源抗氧化肽的纯化、结构鉴定及体外抗氧化活性

范三红， 贾槐旺， 李 兰， 白宝清

(山西大学生命科学学院1，太原 030006)(山西大学特色植物资源研究与利用山西重点实验室2，太原 030006)

紫苏(perillafrutescens)，古称茬，又名苏麻，属我国卫生部首批颁布的药食同源的60种中药之一[1,2]。紫苏原产于我国中南部地区及喜马拉雅山脉，分布位置较广泛，韩国、日本、不丹、印尼等国均有广泛种植，我国主要以湖南、山西、东北等地种植[3]。紫苏在我国具有两千多年的药用历史，其味辛、性温，具有行气、镇痛、利尿、顺气、散寒和化痰之功效，《图经本草》《本草纲目》等多版中国药典均有记录，是一种古老的经济作物[4]。紫苏适应性强，种植简单，管理容易，在我国南北部的荒坡、河滩、沟边等广大地区都可种植。紫苏富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、微量元素及维生素等多种生物活性物质，具有抗过敏[5]、抑菌[6]、消炎[7]、提高免疫力、降血脂、降血压[8]、抗氧化、预防细胞衰老癌变等作用[9]。紫苏籽粕是紫苏籽榨油后的残留物，目前我国紫苏籽粕最大的流向依然是作为畜禽饲料，开发、利用和深加工依然不完善，这不仅是对资源的浪费而且还会造成环境污染[10]。

天然和合成的抗氧化剂通常用于生物系统中的自由基清除。合成抗氧化剂既有效又便宜，然而由于其毒性和对人体健康的副作用，其使用受到严格管制[11]。天然来源的抗氧化活性肽由于其结构简单、分子质量低，与合成化合物相比具有较大优势[12]。赵换维[13]使用提取的杏鲍菇蛋白制备杏鲍菇多肽并研究其体外抗氧化活性，结果表明不同分子质量的杏鲍菇多肽均可实现对自由基活性的有效清除，由此证明杏鲍菇多肽具有良好的抗氧化活性。张维等[14]通过超声破碎法提取鹿茸总多肽,并测定其不同处理时间获得鹿茸总多肽的蛋白浓度;通过细胞培养、细胞增殖活性检测研究鹿茸总多肽的抗炎活性，结果表明，通过超声法提取的鹿茸总多肽能够抑制LPS,诱导RAW264.7细胞IL-6的高表达，具有抗炎作用。贺东亮[15]通过检测经紫苏籽肽PSP3c灌胃后小鼠血液和肝脏组织中多种酶的活力了解PSP3c对小鼠抗氧化能力的影响，结果显示紫苏籽多肽PSP3c能够保护机体免受自由基的攻击，提高小鼠抗氧化能力。

本实验通过闪式提取工艺提取紫苏籽粕蛋白，选取碱性蛋白酶Alcalase对其进行酶解，采用超滤法、DEAE-32离子交换层析以及Sephadex G-25凝胶层析对酶解物进行分离纯化，并对分离纯化后的多肽组分进行抗氧化性跟踪测定，筛选出抗氧化性较强的组分，并测定其分子质量及氨基酸序列，以期为紫苏籽粕蛋白的开发及其酶解活性肽在功能性食品中的应用提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫苏籽粕、碱性蛋白酶(2.0×104U/g)、邻苯三酚、DPPH、ABTS、DEAE-32、G-25Sephadex、乙腈Acetonitrile(A/0626/17)、TCEP(646547)、MMTS(208795)、胰酶(V5280)、甲酸FA(64186)、碳酸氢铵(A6141)、尿素(0568)、10 Ku超滤管(OD 010C33)，试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JHBE-20V实验型闪式提取器，SK-1030超声波清洗仪，868 pH测试仪，SP-2000UV紫外可见分光光度计，SCIENTZ-12N冷冻干燥机，BS-100A自动部分收集器，HD-21-1核酸蛋白检测仪，TH-100梯度混合器，BT-100数显蠕动泵，Dionex Ultimate 3000 RSLCnano-Q Exactive 液质联用仪。

1.3 方法

1.3.1 紫苏籽粕蛋白的提取流程

紫苏籽粕→去杂、粉碎、过筛、脱脂→配制成一定料液比→调节pH→闪式提取→离心机去渣→取上清液调节pH为等电点→离心→蛋白质沉淀→真空冷冻干燥→密封低温保存。

1.3.2 单因素实验

以蛋白提取率为考察指标，选择闪提pH(8、9、10、11、12)、闪提时间(10、20、30、40、50 s)、闪提速率(1 000、2 000、3 000、4 000、5 000 r/min)及料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)4个因素进行单因素实验，考察各因素对蛋白提取率的影响。

1.3.3 响应面优化实验

在单因素实验的基础上，依据Box-Behnken中心组合实验设计原理，选取A闪提时间、B料液比、C闪提pH 3个主要影响因素为独立变量，以蛋白提取率(Y)为响应值设计三因素三水平实验方案，其因素水平如表1所示。

表1 响应面实验因素和水平

1.3.4 紫苏籽粕蛋白酶解产物的制备

以最优工艺条件下制备的紫苏籽粕蛋白为原料，参考贺东亮[15]的方法，经酶解工艺优化，确定选用碱性蛋白酶Alcalase进行酶解，酶解工艺条件为：底物质量分数3%、pH 9.5、酶解温度60 ℃、酶用量7%、酶解时间4 h为最佳酶解条件。酶解结束后经沸水浴10 min灭活，4 500 r/min离心10 min，取上清液即为紫苏籽粕蛋白酶解产物。

1.3.5 超滤法分离抗氧化活性肽

使用装有截留分子质量为3、5、10 ku的聚醚砜超滤膜，在二氧化碳压力为2.5×104Pa下依次对紫苏籽粕蛋白酶解液进行超滤，得到分子质量分别为<3、3～5、5～10 ku以及>10 ku的4种不同分子质量段的超滤组分，真空冷冻干燥以测定抗氧化活性，获得抗氧化活性最强的紫苏籽粕多肽超滤组分[16]。

1.3.6 DEAE纤维素DE-32离子交换层析分离抗氧化活性肽

将抗氧化活性最强的多肽超滤组分，利用DEAE纤维素DE-32离子交换层析继续分离纯化，选用20 mm×400 mm规格层析柱，用50 mmol/L Tris-HCl(pH 8)的缓冲液平衡柱床，上样量3 mL，用0～1 mol/L NaCl平衡缓冲液进行梯度洗脱，流速为1.5 mL/min，紫外检测波长220 nm。将所得分离组分冷冻干燥以测定抗氧化活性，筛选出抗氧化活性最好的组分用于后续凝胶色谱的分离纯化。

1.3.7 凝胶色谱Sephadex G-25分离抗氧化活性肽

使用凝胶色谱Sephadex G-25继续分离纯化经离子交换层析分离获得的抗氧化活性最好的多肽组分，选用16 mm×300 mm规格层析柱，洗脱条件为：用100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)的平衡缓冲溶液，上样量3 mL，洗脱流速0.5 mL/min，紫外检测波长220 nm。分离纯化后的组分冷冻干燥以测定其抗氧化活性，将抗氧化能力最强的组分进行结构鉴定。

1.3.8 紫苏抗氧化肽氨基酸序列质谱分析

1.3.8.1 蛋白酶水解

蛋白液加4 μL 0.05 mol/L TCEP 溶液，60 ℃反应1 h；还原后，加入2 μL 55 mmol/L MMTS溶液，室温避光45 min；将蛋白液加入10 ku 超滤管，12 000 g离心20 min；加入100 μL UA(8 mol/L尿素pH 8.5)溶液，12 000 g离心20 min,离心2次；加入100 μL 0.25 mol/L TEAB,12 000 g离心20 min，重复3次；加入50 μL 0.5mol/L TEAB，加入2%胰酶(胰酶与蛋白质量比为1∶50)，37 ℃孵育过夜(12 h)；次日补加1%胰酶(胰酶与蛋白质量比为1∶100)，37 ℃孵育4 h；更换新的收集管，离心收集滤液，低温真空抽干[17]。

1.3.8.2 质谱鉴定

肽段用样品溶解液(0.1%甲酸、2%乙腈)溶解， 13 200 r/min，4 ℃离心20 min，取上清，进行质谱鉴定。

液相参数：捕集柱：Acclaim PepMap RSLC C18(300 μm 5 mm, 5 μm, 10 nm)；分析柱：Acclaim PepMap C18(75 μm×150 mm, 3 μm，10 nm)；流动相A∶0.1%甲酸、流动相B∶0.1%甲酸，80%CAN、流速：300 nL/min；梯度分离：B相从5%上升至90%(0 min-5%、5 min-5%、45 min-50%、50 min-90%、55 min-90%、65 min-5%)。

分离后的肽段直接进入质谱仪Thermo Scientific Q Exactive进行在线检测，具体参数为：一级质谱参数，分辨率：70 000、AGC：目标3e6、最大喷射时间：40 ms、扫描范围：350～1 800m/z；二级质谱参数， 分辨率：17 500、AGC 目标：1e5、最大喷射时间：60 ms、TopN ：20、NCE / stepped NCE：27。

1.3.9 抗氧化能力测定

1.3.9.1 DPPH自由基清除能力测定

取3 mL待测溶液，加入1mL DPPH·乙醇溶液(40 μg/mL)，避光放置30 min，测定吸光度A1(517 nm)；3 mL蛋白溶液和1 mL乙醇溶液(40 μg /mL)混合，测定吸光值A2；3 mL乙醇和1 mL DPPH·乙醇溶液(40 μg /mL)混合测定吸光度值A0[18]，DPPH自由基清率除按式(1)进行计算。

(1)

1.3.9.2 超氧阴离子清除能力测定

依次加入pH 8.2的Tris-HCL缓冲液6 mL和3 mL待测溶液，37 ℃恒温10 min，加入1 mL邻苯三酚溶液(3 mmol/L)，反应4 min，用0.5 mL的盐酸(0.5 mol/L)结束反应，测吸光度(320 nm)值A1，以蒸馏水代替蛋白溶液和邻苯三酚分别测吸光度A0和A2；超氧阴离子清除率按式(1)进行计算[19]。

1.3.9.3 羟自由基清除能力测定

加入1 mL FeSO4(9 mmol/L)溶液、1mL水杨酸-乙醇溶液(9 mmol/L)、1 mL待测溶液，最后加入1 mL H2O2启动反应，37 ℃水浴30 min，510 nm处测定吸光度A1；用蒸馏水分别代替H2O2和蛋白溶液测定吸光度A2和A0；羟自由基清除率按式(1)进行计算[20]。

1.3.9.4 ABTS自由基清除能力的测定

加入0.1 mL待测溶液，加入3.9 mL ABTS工作液，混匀精确反应6 min，734 nm下测定吸光度值A1；以无水乙醇和蒸馏水分别代替工作液和蛋白溶液测定吸光度值A2和A0；ABTS自由基清除率按式(1)进行计算[21]。

1.3.9.5 铁离子还原能力测定

1 mL的待测溶液、1 mL磷酸缓冲液(pH 6.6)和1 mL铁氰化钾(1%)混匀，50 ℃水浴20 min，冷却至室温，加入1 mL三氯乙酸(10%)，3 000 r/min离心10 min，2 mL上清液、 2 mL蒸馏水和1 mL三氯化铁(0.1%)混匀，反应10 min，在700 nm处测定吸光度[22]。

1.3.10 数据分析

每组样品重复测试3次，所有的实验数据均以平均值 ± 标准偏差表示，实验结果采用Origin 8.5软件绘制图表，采用Design Expert 8.0.6软件进行Box-Behnken设计及分析。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

如图1所示，在测试pH范围内，当pH为8～10时，提取率随pH的增大而升高；当pH为10时提取率为46.2%，达到最大值。pH为10～12时，提取率快速下降，可能是强碱导致蛋白开始变性，闪提加快了蛋白分子与强碱的接触，使蛋白质的变性速率增快，导致提取率下降[23]。在闪提时间从10～30 s时间段，提取率随时间的增加不断升高；闪提时间30 s时提取率达到最大45.8%。继续延长闪提时间，蛋白提取率开始缓慢下降，可能的原因是原料蛋白达到限定条件下的最大溶解且与提取液充分接触，提取率已无上升空间，而随着闪提时间延长，高速运转的闪提器转子与提取物摩擦产生的高温使得料液温度升高进而导致部分蛋白因高温产生变性[24]。在闪提速率1 000～3 000 r/min内，提取率随着闪提速率的增加而升高；这是因为不断增速的闪提进一步加速了蛋白的溶解；当闪提速率达到3 000 r/min时，提取率达到最大44.9%。继续增加转速，高转速加快了转子与提取物的摩擦导致料液温度升高，高温使部分蛋白质开始变性从而使得提取率开始逐渐降低[25]。在测试料液比范围内以1∶20为分界点，蛋白提取率先逐渐升高后逐渐降低；因为随着料液比的扩大，蛋白与提取液接触面积增大，加速了蛋白的溶解，从而使得提取率不断增加；继续扩大料液比的比值，提取体系变大，短时间的闪提操作不能使得蛋白完全溶出，从而导致蛋白提取率不升反降[15]。根据单因素实验结果，选取pH 10、碱提时间20 min、闪提速率3 000 r/min、料液比1∶20为最佳闪式提取单因素。

图1 闪式提取紫苏籽粕蛋白单因素实验

2.2 响应面实验

以单因素实验结果为依据，依据Box-Behnken中心组合实验设计原理，采用闪提时间(A)、料液比(B)和闪提pH(C)中影响显著的中心值，以紫苏籽粕蛋白提取率为指标做响应面分析实验，响应面实验方案及结果见表2使用Design Expert8.0.6软件对表2中的数据进行多元回归拟合，构造提取工艺参数回归模型。紫苏籽粕蛋白提取率为Z值，得出闪提时间(A)、料液比(B)和闪提pH(C)的二次多项回归预测模型方程：

Z=46.64+0.50A-0.57B+1.06C+1.05AB-0.70AC-0.16BC-4.84A2-1.55B2-3.15C2。

表2 响应面实验设计及结果

表3 回归模型各因素方差分析

经Design-Expert 8.0.6软件分析可得最佳工艺条件为料液比1∶19.08、闪提pH 10.17 、闪提时间30.19 s，相应的响应面二次模型预测紫苏籽粕蛋白提取率为46.78%。为验证该响应面法的可行性，考虑到实际操作的可行性，选取料液比1∶20、闪提pH 10、闪提时间30 s，修正条件下进行3次平行实验，结果表明紫苏籽粕蛋白提取率稳定在(46.54±0.17)%，与预测值基本相同，说明该实验模型可以较好地预测紫苏籽饼粕蛋白的实际提取效果，具有应用价值。

2.3 紫苏籽粕蛋白抗氧化能力测定

图2 紫苏籽粕蛋白的抗氧化活性

2.4 超滤分离纯化组分的抗氧化性分析

但也有研究表明小分子质量的多肽不一定都具有最强的抗氧化活性，张爽等[29]研究发现鲍鱼外套膜酶解物分子质量<1 ku组分的羟自由基和DPPH自由基清除力要弱于分子质量为3～5 ku的组分，说明肽的抗氧化活性与其分子质量大小相关，但同时也可能受到其氨基酸的序列及组成的影响。

注：a为指标测试最小值；aa为与所测指标最小值比较差异显著(P<0.05)；AA为与所测指标最小值比较差异极显著(P<0.01)。以1 mg/mL的质量浓度测试DPPH自由基清除活性、3 mg/mL的质量浓度测试自由基清除能力和铁离子还原能力，下同。图3 紫苏籽粕蛋白酶解液和超滤分离级分的抗氧化活性

2.5 DEAE纤维素DE-32离子交换层析分离纯化紫苏抗氧化肽

图4 离子层析分离纯化分子质量<3 ku紫苏籽抗氧化肽

图5 离子层析分离纯化分子质量<3 ku紫苏籽抗氧化肽各组分的抗氧化活性

2.6 凝胶色谱Sephadex G-25分离纯化紫苏抗氧化肽

图6 凝胶层析分离纯化紫苏籽抗氧化肽D1

图7 凝胶层析分离纯化紫苏籽抗氧化肽D1后各组分抗氧化活性

表4 紫苏籽粕蛋白水解物中获得的抗氧化活性肽的纯化汇总

2.7 紫苏抗氧化肽分子质量及氨基酸序列测定

如图8所示，通过LC-MS-MS鉴定，分析并获得G1的准确MS数据，该肽段由15个氨基酸组成，荷质比m/z为672.39，分子质量为1 718.82 u，其氨基酸序列为EMPYIASMGIYVVSK，即谷氨酸(Glu)- 蛋氨酸(Met)- 脯氨酸(Pro)- 酪氨酸(Tur)- 异亮氨酸(lle)- 丙氨酸(Ala)- 丝氨酸(Ser)- 蛋氨酸(Met)- 甘氨酸(Gly)- 异亮氨酸(lle)- 酪氨酸(Tyr)- 缬氨酸(Val)- 缬氨酸(Val)- 丝氨酸(Ser)- 赖氨酸(Lys)。较短的肽(5～16个氨基酸)比分子质量较大的多肽表现出更强的抗氧化活性，这是因为它具有更好的穿过肠道屏障的能力，并且与自由基的相互作用更容易[30]。一些氨基酸对于肽的抗氧化活性至关重要，含有疏水性氨基酸的肽有助于其脂质溶解度的增加，从而有助于增加其抗氧化活性[31]。此外，疏水性氨基酸能够通过疏水性缔合促进肽进入靶器官，便于其发挥抗氧化特性。因此，本实验中经纯化获得的抗氧化活性肽G1组分中存在的疏水性氨基酸残基lle、Pro、Tyr、Ala和Val，在抗氧化活性肽能够有效清除自由基的过程中起到重要的作用。

图8 抗氧化肽G1组分的质谱分析图

3 结论