DHA藻油纳米乳液制备及稳定性的研究

张程超， 蔡伊娜， 彭池方， 王正武

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室1，无锡 214122)(江南大学食品学院2，无锡 214122)(深圳海关食品检验检疫技术中心3，深圳 518045)(上海交通大学农业与生物学院4，上海 200240)

微藻油富含二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic acid，DHA)和二十碳五烯酸(EPA)等ω-3 多不饱和脂肪酸。这些脂肪酸不仅对人体大脑发育、提高记忆力、预防心血管疾病以及抗炎等领域有很好的生理作用[1,2]，而且对婴幼儿视网膜以及认知能力的形成非常重要[3]；这推动了微藻油产品已经广泛应用于食品、保健品、医药和饲料行业中。由于DHA等ω-3 多不饱和脂肪酸分子中双键数目较多，在加工、运输和贮藏过程中容易氧化，尤其是因加热造成的脂肪酸氧化生成氢过氧化物，然后会进一步氧化生成醛、酮、酸等小分子化合物，产生哈喇味，严重影响油脂品质[3,4]。采用乳化或微胶囊包埋微藻油是提高其应用稳定性的重要途径[5]，目前国内外已有大量这方面的研究工作报道。例如，He等[6]用Surfactin作为表面活性剂制备藻油乳状液的方法，并进行模拟消化实验研究乳状液对藻油的保护效果，为藻油乳状液在食品中的实际应用打下基础，但是该乳液体系的高温稳定性尚未评估。袁博[7]采用复凝聚法对藻油进行包埋，冷冻干燥得到微胶囊产品。通过控制包埋体系的zeta-电位、浊度和微胶囊的形态优化了复凝聚过程，同时研究了藻油微胶囊的氧化稳定性，但是仅评价了最高60 ℃下的热稳定性。

多层纳米乳液是由多层(而非单层)界面层包含油滴的纳米乳液。多层乳液可完全由食品级原料(如表面活性剂、蛋白质、多糖、磷脂)形成[8]，其加工操作是食品工业常见的单元操作(如均质与混合)。通过控制多层乳液纳米层状结构的组成和性质，可显著提升纳米乳滴在环境压力下的稳定性[9]，如高酸碱、高盐、加热、冻融等。目前，采用双层乳液包埋β-胡萝卜素[10]、姜黄素[11]、叶黄素[12]、鱼油[13]、橙皮苷[14]等物质的研究报道较多，但包埋藻油的研究较少。本研究选用阿拉伯胶和乳清分离蛋白通过层层自组装实现了DHA藻油的包埋，并系统评估了所制备双层纳米乳液的稳定性；以期能够得到在贮藏和加工过程，尤其在高温下的高稳定性藻油产品，为藻油在更多种类食品体系中的应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清分离蛋白(食品级)；阿拉伯胶(食品级)；DHA藻油；其他实验试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FJ-200高速分散均质机，JHG-54-P100高压均质机，纳米粒度与zeta电位仪，气相色谱仪Agilent 7820A，流变仪DISCOVERY DHR-3。

1.3 实验方法

1.3.1 DHA藻油单层纳米乳液的制备

制备质量分数为0.5%～2.5%的WPI溶液，加入质量分数为0.02%的苯甲酸钠作为防腐剂，在25 ℃下以1 000 r/min的转速磁力搅拌30 min，加入质量分数1.5%的油相，使用高速剪切机以12 000r/min的转速高速剪切3 min，得到粗乳液，再使用高压均质机进行二次高压均质，一级50 MPa，二级5 MPa，循环3次，形成由乳清分离蛋白包埋的DHA藻油单层纳米乳液WPI-e。

1.3.2 DHA藻油双层纳米乳液的制备

制备质量分数1%～3%的GA溶液形成水相，将GA水相和藻油单层纳米乳液的pH调节至4.0[15]，两者按照一定的体积比混合，最后用高压均质机进行2次高压均质，一级50 MPa，二级5 MPa，形成内层为WPI外层为GA的双层纳米乳液WPI-e /GA。

1.3.3 纳米乳液颗粒粒径、粒径分布指数以及Zeta电位的测定

使用纳米粒度及ZETA电位仪测定藻油纳米乳液的粒径、粒径分布指数及Zeta电位[16]，仪器参数设置为：固定角度90°，背散射光角度为173°，相对折射率为1.590，吸收率为0.001，在25 ℃的温度下测试，每个样品重复3次。

1.3.4 DHA藻油中不饱和脂肪酸的测定

油脂中不饱和脂肪酸含量测定参考国家标准GB 5009.168—2016[17]。

1.3.5 乳液的稳定性测试

1.3.5.1 乳液的热稳定性

分别取10 mL不同的单、双层藻油乳液加到试管中，然后对其进行避光恒温加热，温度分别设定成40～90 ℃，在加热1 h之后立即取样，用水冷待其冷却完毕，测定乳液的PDI、粒径和Zeta电位，每个样品重复3次。同时，在40、60、80、90 ℃处理之后测试每个样品经过热处理其DHA的含量。

分别取不同的单、双层藻油乳液10 mL加入到密封好的耐高温试管，分别设置油浴锅的温度120、150 ℃对其加热20 min立即取出冷却到室温，测定乳液的PDI、粒径和Zeta电位同时测试每个样品热处理之后的DHA含量。每个样品重复3次。

1.3.5.2 乳液的冻融稳定性

分别取5 mL乳液加入到10 mL离心管中，并置于-20 ℃的温度下冷冻0～12 h。冷冻完毕之后将离心管取出在37 ℃恒温水浴锅中解冻1 h，测定其PDI、粒径和Zeta电位。每个样品重复3次。

1.3.5.3 乳液对盐的耐受性

使用0.1～0.5 mol/L的NaCl溶液分别将藻油乳液稀释100倍，充氮气在4 ℃冰箱中避光保存1 h之后取样，立即测定乳液的粒径、PDI、Zeta-电位。

1.3.5.4 乳液对酸碱的耐受性

取15 mL藻油乳液加入到50 mL离心管中，用1 mol/L的HCl或者1 mol/L的NaOH将乳液pH调整为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，充氮气在4 ℃下保存1 h后立即取样，测定其粒径、PDI和电位。

1.3.4.5 乳液的贮藏稳定性

将样品在常温下封口保存7周后，每周取1次样测定其粒径，PDI和Zeta-电位。

2 结果与分析

2.1 纳米乳液的制备

粒径，粒径分布和电位是乳液的重要表征手段，乳滴的粒径越小，乳液的布朗运动越弱，从而越稳定；乳液的粒径分布越均匀，其性质均一性越好[18]；液滴之间的静电排斥作用力越大越不容易絮凝成大液滴，乳液的乳滴的Zeta电位绝对值一般大于20 mV时其稳定性较好[19]。

同时在制备纳米乳液的过程中需要控制好乳化剂和油相的含量，才能制备出稳定的乳状液。在预实验中发现油相质量分数高于1.5%时，采用WPI蛋白乳化难以得到充分乳化的乳液，因此，本研究乳化体系设定油相质量分数为1.5%。并且，选用WPI蛋白和阿拉伯胶多糖作为制备双层纳米乳液时，初步实验发现，WPI蛋白为内层多糖为外层可制备得到肉眼可见稳定的乳液，而采用多糖为内层WPI蛋白为外层乳化油相，难以得到稳定的纳米乳液。因此，后续进一步对WPI蛋白为内层多糖为外层制备DHA藻油乳液时的条件开展了详细分析。

2.1.1 不同WPI浓度对单层纳米乳液的影响

由图1可知，随着乳清分离蛋白浓度的增加，DHA藻油单层纳米乳液的粒径和PDI随着WPI的浓度升高而下降并在蛋白质质量分数达到1.5%后趋于稳定，此时粒径为262 nm，PDI为0.182，在低蛋白浓度时，油脂不能被很好的包埋，有一部分油脂破乳之后聚集在一起粒径增大，而增加乳化剂含量之后乳清分离蛋白颗粒紧密排列在藻油表面，更好地包封住油脂且不发生絮凝[20]，使粒径降低。但是从图1看出由于只用了蛋白作为单层乳化剂，液滴所带电荷随着其含量上升略有升高，但数值仍然较小低于20。Li等[21]用乳清分离蛋白制备百里香精油纳米乳液时，得到了和本实验相似的结果。

图1 WPI浓度对单层乳液粒径、PDI和Zeta-电位的影响

2.1.2 阿拉伯胶浓度和内外层乳化剂比例对双层乳液的影响

将WPI质量分数为1.5%时制备的单层乳液进一步采用阿拉伯胶乳化，并控制多糖蛋白体积比为7∶3。如图2所示，随着GA质量分数升高，乳液的粒径和PDI均逐渐降低，并在2.5%之后趋于稳定。当GA质量分数为1%时，乳液的粒径为565 nm，显著高于单层乳液的粒径262 nm。这是由于GA为阴离子多糖，当其没有完全包覆油滴外的WPI蛋白分子时，纳米粒子之间会存在其与WPI分子暴露基团之间的静电相互作用；较低的Zeta电位(-19.5 mV)也可证明这一点。当GA质量分数为2.5%时，乳液的粒径为354 nm，其相对单层乳液粒径的增加(93 nm)可主要归因于GA分子在WPI分子外的堆积。此时Zeta电位也显著增加(-25 mV)，也暗示GA分子已将包裹油滴的WPI蛋白分子充分包覆[22,23]。

图2 不同阿拉伯胶浓度对双层乳液粒径、PDI和电位的影响

2.2 两种乳液在不同条件下的稳定性比较

食品在企业生产或者日常使用中常常会经历一些加工过程，比如高温、盐离子的添加、冻融、改变酸碱性等，而由于藻油DHA含有不饱和双键，在这些条件下很容易氧化降解变质，因此各种藻油传输系统需要抵抗食品加工和贮藏带来的压力。为了方便比较，在做乳液稳定性评估时，两种乳液体系的pH均为4.0。

2.2.1 两种纳米乳液室温贮藏稳定性

将两种乳液在常温下贮藏7周后，测试了其粒径、Zeta电位的变化、以及DHA保留率，以评估其理化稳定性。如图3所示。随着贮藏时间的延长，在常温下储藏7周后，双层乳液的粒径和PDI分别从354 nm和0.22缓慢增加至525 nm和0.67，而单层乳液的粒径大幅增加到1 150 nm，PDI增加到0.98，增幅均显著高于双层乳液。双层乳液的电位较高，并且基本保持不变，有利于纳米颗粒的稳定，并减少絮凝；而单层纳米乳液的电位较低，液滴之间的静电排斥作用力较小，乳液中的纳米粒子之间更容易慢慢靠近聚集形成更大颗粒，并诱导油脂破乳。随着贮藏时间的延长，双层纳米乳液的DHA仍保留了81.44%，而单层纳米乳液的DHA仍保留率下降至70.62%。这也证实了双层乳化剂对藻油的氧化保护作用明显高于单层乳化剂[24]。本实验的结果与Tang等[25]的研究相一致。

图3 储藏时间对不同乳液理化性质的影响

2.2.2 乳液的热稳定性

将两种乳液在40～90 ℃下加热1 h后，分析其变化。结果可见，随着温度的升高双层乳液的乳滴粒径和PDI未发生明显变化，而单层纳米乳液在70 ℃时粒径已经达到了1 286 nm(图4a)，且随着温度上升，其粒径仍不断增加。经90 ℃热处理后，双层乳液中DHA的质量分数相比较未被加热处理过的样品分别减少了39.2%和7.7%，在120 ℃和150 ℃加热20 min之后，两种乳液的粒径都因为高温而增加，DHA保留率分别为60.3%、56.4%和85.2%、81.8%(图4b)。这是因为热处理使得单层纳米乳液中蛋白质的二级结构展开破坏了保护膜[26]，而双层纳米乳液中GA将WPI蛋白分膜充分包覆，且膜层较厚，因此能够显著削弱高温的影响。

图4 热处理对不同乳液理化性质的影响

2.2.3 乳液的冻融稳定性

由图5可知，随着冷冻时间的延长，两种乳液的粒径和PDI均不断增大。冷冻2 h以后，两种乳液的粒径已有显著增加，分别达到557.3 nm和524.1 nm；但是单层乳液的粒径已经大于双层乳液。冷冻12 h之后，单层乳液的粒径和PDI增加至1 461 nm和1，双层纳米乳液增长至1 116 nm和0.92。这可归因于单层乳化剂形成的保护膜易被冷冻时产生的晶破坏，而由双层乳化剂形成的保护膜更厚，因而更能抵抗冰晶的破坏[27]。

图5 冷冻-解冻后不同乳液粒径的变化

2.2.4 乳液对酸碱的耐受性

食品加工过程中通常会加入食品添加剂，这会改变体系的酸碱性，因此乳液对酸碱的耐受性也是其在食品体系中应用的重要考量因素。如图6所示，在pH 2～8范围内，单层乳液体系的粒径pH=5时突然升高，粒径跃升到1 546 nm，PDI为1；而双层乳液的粒径在pH值2.0到8.0范围，一直保持稳定，除了pH=2时其粒径跃升为818 nm。出现这一现象的原因主要是pH的变化改变了乳液体系的电位。由图7b可知，单层乳液的电位在pH为5时绝对值接近0，此时接近乳清分离蛋白的等电点[28]。

图6 pH对不同乳液粒径和电位的影响

而双层乳液在酸性条件下的粒径增大是因为此时电位绝对值较低，静电斥力不够造成液滴聚集成大颗粒；此结果与Saman等[29]的研究结果一致。

2.2.5 盐浓度对乳液稳定性的影响

液态食品体系中通常会存在一些盐离子，可能对纳米乳液的状态产生影响。本研究选用不同浓度的NaCl添加到两种纳米乳液中，分析了其对乳液物理稳定性的影响。如图7所示，随着Na+浓度上升，单层乳液的粒径增尤其明显并开始出现分层现象，相比之下双层乳液粒径随着金属离子的浓度从0.1～0.5 mol/L，只增加了100 nm，PDI的变化也呈同样的趋势，出现这种现象的原因是金属离子产生的静电屏蔽效应[30]，由图7b可知两种乳液的电位绝对值都随着离子浓度的上升而降低，带正电的Na+会中和液滴表面带的负电。而双层乳液较厚的界面膜对静电屏蔽作用的抵抗力会提高，所以双层乳液能产生比单层乳液更好的盐离子耐受性。

图7 NaCl浓度对不同乳液粒径和电位的影响

3 结论

本研究基于层层自组装和高压均质制备了一种藻油双层纳米乳液。其制备的最佳工艺参数为：高压均质压力50 MPa，均质次数3次，内层用乳清分离蛋白作为乳化剂，最佳质量分数1.5%，外层为阿拉伯胶最佳质量分数为2.5%，藻油质量分数为1.5%，此时的藻油纳米乳液粒径为354 nm，PDI为0.22，Zeta-电位为-25 mV。该纳米乳液对热、冻融、盐和酸碱均显示出具有较高的耐受性，且长期贮藏稳定较好。本研究可为DHA藻油高稳定性产品的开发及其在食品加工中的应用提供技术参考。