气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)测定大米中25种农药及其代谢物残留

张 蕊， 朱 琳， 李乐乐， 王松雪， 张 冰， 叶 金， 郭宝元

(国家粮食和物资储备局科学研究院1，北京 100037)(吕梁学院2，吕梁 033099)

水稻是我国三大粮食作物之一，2019年我国稻谷总产量达20 961.4万t[1]。据统计，我国稻谷约85%用于大米加工，多作为口粮直接食用[2]。水稻种植过程中，为了降低病虫害的影响，农药必不可少。伴随着化学农药的应用，不可避免地产生了农药残留问题，尤其是不科学、不规范的用药给粮食质量安全带来了巨大风险隐患[3]。大米中的农药残留主要来源于水稻生产中使用的化学农药，虽然加工可以减少大米中农药残留水平，但大米中农药残留风险依然存在。为保护消费者健康，食品安全国家标准GB 2763—2019《食品中农药最大残留限量》对大米中的农药残留做出了明确的规定[4]。

有关大米中农残检测技术研究国内外均有报道[5-11]。检测方法主要有高效液相色谱法[5]、气相色谱法[6]、液质联用法[7-9]和气质联用法[10-14]。由于三重四极杆质谱法具有检测下限更低、灵敏度更高的优点，在农残分析中气相色谱-串联质谱法(GC-MS/MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)得到了广泛的应用。目前大米中农残检测GC-MS/MS法研究报道不少，但针对于GB 2763—2019中大米限定的农残分析研究还很少，关于保护剂在大米中农残检测的应用研究很少。现基于GC-MS/MS法的农残分析国家标准仅一项[13]，且需要溶剂转化，存在耗时、容易损失农残目标物等问题。本研究立足于国家食品安全标准GB 2763—2019，以大米中25种农药及其代谢物残留为检测对象，深入探讨了保护剂对基质效应的影响，建立一种基于气相色谱-串联质谱法检测大米中多农药残留的快速方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料：大米。

实验耗材：乙腈(色谱纯)；乙酸(色谱纯)；乙酸乙酯(色谱纯)；蒸馏水；PSA；C18(40～60 μm)；无水硫酸镁(分析纯)；氯化钠(分析纯)；50 mL和15mL离心管；0.2 μm滤膜；L-古洛糖酸内酯(分析纯)；D-山梨醇(分析纯)。

标准品: 丙草胺、稻丰散、稻瘟灵、敌稗、敌瘟磷、丁草胺、氟酰胺、甲基毒死蜱、甲基嘧啶磷、甲奈威、喹硫磷、马拉硫磷、杀螟硫磷、异丙威、艾氏剂、p,p’-滴滴涕、p,p’-滴滴涕、p,p′-滴滴伊、p,p′-滴滴滴、狄氏剂、α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、七氯、禾草敌、氯虫苯甲酰胺、氯氰菊酯、三唑磷、溴氰菊酯、顺-氯丹、反-氯丹，浓度均为1 000 μg/mL；外环氧七氯B，质量浓度为100 μg/mL。

1.2 仪器与设备

TSQ 8000气相色谱三重四极质谱联用仪，5810R离心机，TARGIN VX-Ⅲ多管涡旋振荡器。

1.3 保护剂配制

配制含20 mg/mLL-古洛糖酸内酯以及10mg/mLD-山梨醇混合溶液。

1.4 标准溶液的配制

内标溶液：配制5 mg/L外环氧七氯B内标溶液。

农药混标：配制25种农药及其代谢物混合标准的储备液，于-20 ℃保存。使用大米基质空白液将储备液逐级稀释为2.5、5、10、50、100 μg/L标准工作溶液。

基质匹配标准工作上机液：移取上述各浓度标准工作溶液1 mL，加入20 μL内标溶液，涡旋混匀后，再从中移取500 μL，加入20 μL保护剂，备用。

1.5 样品处理

样品经粉碎过20目筛后，准确称取5.00 g(精确至0.01 g)于50 mL离心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合溶剂，涡旋摇匀20 min，以7 000 r/min离心5 min使固液分离。转移10 mL上清液于50 mL离心管中，加入2.0 g无水硫酸镁和0.8 g氯化钠，振摇后，再次涡旋5 min，7 000 r/min离心5 min。待净化。

移取上清液2 mL于装有300 mg无水硫酸镁、50 mg PSA、50 mg C18的15 mL离心管中，振摇后涡旋混匀5 min，7 000 r/min离心5 min，取上清液过0.2 μm滤膜。

移取1 mL上述净化液，加入20 μL内标溶液，涡旋混匀，再从中移取500 μL，加入20 μL保护剂。

1.6 仪器条件

1.6.1 色谱条件

色谱柱：(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷石英毛细管柱；30 m×0.25 mm×0.25 μm；

色谱柱温度：50 ℃，保持1 min，以50 ℃/min升温至120 ℃，以4 ℃/min升温至240 ℃，以12 ℃/min升温至300 ℃，保持5 min；载气：氦气，纯度≥99.999%，流速1.0 mL/min;进样口温度：280 ℃；进样量：1 μL；进样方式：不分流进样。

1.6.2 质谱条件

25种农药及其代谢物和内标化合物的质谱条件为电子轰击源：70 eV；离子源温度：300 ℃；传输线温度：280 ℃。多反应监测：每种农药分别选择一对定量离子、一对定性离子。每种农药的保留时间、定量离子对、定性离子对和碰撞电压，见表1。

表1 25种农药及其代谢物和内标化合物的质谱条件

2 结果与分析

2.1 仪器条件的选择

25种农药及其代谢物、内标化合物的沸点各不相同，如果采用恒温色谱分析，低沸点组分因柱温太高很快流出，峰形非常尖锐，而高沸点组分因柱温太低和区域扩散，峰形扁平，影响准确定量，因此本实验采用程序升温。为方便用户使用，本实验选择了最常见的HP-5MS弱极性色谱柱，而未选择GB 23200.113—2018推荐的中等极性色谱柱[13]。

实验中通过仪器SRM优化软件，确定了25种农药及其代谢物、内标化合物的母离子、子离子以及碰撞能，并选择响应高、干扰小的离子对作为定量离子对，另一对作为定性离子对，见表1。一般气质离子源温度设置在200～300 ℃之间，随着离子源温度提高，离子化效率提升，灵敏度增加，特别是沸点高的物质。实验中使用100 μg/L 混标，采用SRM模式，考察了不同离子源温度(260、280、300 ℃)对25种农药及其代谢物、内标化合物响应的影响。在每个离子源温度下重复进样4次，计算各自相对标准偏差，同时不同温度下质谱峰响应平均值与300 ℃下质谱峰响应平均值比较，结果见图1、图2。从图1、图2可以看出，离子源温度在260～300 ℃范围内时，α-六六六及其异构体、三唑磷、丙草胺、喹硫磷、氟酰胺、氯氰菊酯、氯虫苯甲酰胺、溴氰菊酯随着离子源温度升高，灵敏度呈增加趋势；外环氧七氯B、七氯、敌稗、禾草敌随着离子源温度升高，灵敏度呈下降趋势。总体上离子源温度280 ℃略优于300 ℃，但两者响应差距不显著，部分农药在离子源温度260 ℃下响应降低明显，离子化效率低。GB 23200.113—2018中离子源温度设定为280 ℃，但本实验考虑到离子源在高温下不易脏，最终将离子源温度设定为300 ℃。

2.2 农残前处理方法的优化

提取是农药残留检测很关键的一步，对检测结果有着直接的影响。乙腈的溶解性好，渗透力强，适合的农药极性范围相对广泛，乙腈适当酸化，能促进农药从组织中溶出，改善提取效率[15]。本研究采用20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合液直接提取样品[16]，涡旋20 min后离心。

提取上清液中含有大量水分，无法直接进行气质分析，必须将水分除掉。盐析能减少有机溶剂在水中的溶解度，使提取液中的水分含量减少。目前国家标准GB 23200.113—2018中盐包使用量大，盐析发热明显，如操作不当，会造成局部过热，甚至烫伤。因此本研究对前处理进行优化，选择了2.0 g无水硫酸镁和0.8 g氯化钠作为盐析剂，加入过程中不会造成局部过热，除水效果理想。盐析剂可实验室自行配制，操作简单，降低检测成本。

在盐析液中存在少量蛋白、脂肪等杂质，干扰后续分析，因此需要进一步净化。常用的吸附填料有PSA、C18、石墨化碳黑GCB等。PSA可以有效去除脂肪酸、蛋白质等极性干扰物质；C18净化剂可去除脂类、蜡类等非极性干扰物质；GCB表面由6个碳原子构成平面六角形，能有效吸附色素。大米中基本不存在色素干扰，因此选用PSA和C18作为净化剂，同时加入一定量的无水硫酸镁吸附盐析液中残留的少量水分。本研究中净化剂比例参考GB 23200.113—2018添加。

图1 不同离子源温度下响应值比值

图2 不同离子源温度下响应值的相对标准偏差

GB 23200.113—2018净化后需进行溶剂转化，将溶剂乙腈转化为乙酸乙酯，再进行气质分析。考虑到溶剂转化过程存在耗时、容易损失农残目标物的缺点，且目前很多品牌的色谱柱可耐受乙腈， 因此本研究采用净化后直接进样。整个前处理过程操作简便、快速、可实现批量处理。

2.3 方法学验证

2.3.1 保护剂对基质效应的影响

基质效应(matrix effect，ME)是指样品中除分析物以外的组分对分析物的离子化产生增强或抑制作用，影响分析结果的准确性[17]。目前基质效应评价方式主要有两种，一种是基于目标物响应值(峰面积)，即基质中目标物响应值与纯溶剂中目标物响应值的比值[17]；一种是基于标准曲线斜率，即基质匹配标准曲线斜率与纯溶剂配制标准曲线斜率的比值[18]。两种方法的计算理论依据一致，表述方式略有不同。实验中对两种评价方式进行了比较。方法一采用100 μg/L纯溶剂(乙腈)标液及基质标液，方法二采用2.5～100 μg/kg线性范围内的基质匹配标准曲线斜率与纯溶剂配制标准曲线斜率(外标法)，大米中25种农残及其代谢物的基质效应结果见图3。可以看出，基质对所有农药有明显增强作用，与文献报导在气相色谱中主要表现为基质增强效应结论一致[14]。在气相色谱中，基质成分的存在减少了色谱系统活性位点与待测物分子作用的机会，使得待测物的检测信号增强[14]。除δ-六六六、γ-六六六2种农药略有差距外，其他农药两种基质效应评价方式结果具有很好的一致性。标准曲线通过多点线性回归获得，因此，标准曲线斜率比值比单点响应值比值具有更强的稳健性。

一种比较常见的补偿基质效应的方法是加入分析保护剂。分析保护剂可以与待分析农药竞争衬管中的活性位点，也可降低高温不稳定的农药在进样口的分解率，从而提高纯溶剂中农药标准品的响应值，达到与基质中农药同等的响应[19]。实验中考察了L-古洛糖酸内酯和D-山梨醇保护剂对响应的影响。分别配制了100 μg/L纯溶剂(乙腈)标液、基质标液、含保护剂的溶剂标液、含保护剂的基质标液四种标液。不同标液中农药的响应值与含保护剂的溶剂标液中相应农药的响应值比较，见图4。保护剂的加入对于纯溶剂中多数农药(除氯虫苯甲酰胺外)有显著增强效应，特别是甲萘威。狄氏剂、顺-氯丹、反-氯丹3种农药受基质影响不大。丁草胺、丙草胺、喹硫磷、敌稗、氟酰胺、氯虫苯甲酰胺等农药含保护剂的溶剂标液与基质标液响应差距显著，因此用含保护剂的溶剂标液作为定量标准曲线并不合适。对于大米中多数农药(丁草胺、敌瘟磷、氟酰胺、溴氰菊酯、甲萘威除外)，当纯溶剂标液和基质标液中加入相同量的保护剂，可以补偿纯溶液基质效应，削弱基质溶液的基质效应。因此，在实际测定过程，可采取基质标曲或是保护剂基质标曲作为样品定量标曲。

图4 保护剂对响应值影响的对比

2.3.2 线性范围

为了提高方法的准确性，降低基质效应的影响，本实验采用保护剂基质匹配内标曲线进行定量。在2.5～100 μg/kg范围内，大米中25种农残及其代谢物线性良好，R2≥0.995，可用于定量，见表2。

表2 大米中25种农残及其代谢物的标准曲线

续表2

2.3.3 加标回收率、定量限及检出限

取空白大米样品，分别添加不同浓度的混合标准溶液，获得10、20、100、200 μg/kg添加水平样品，每个加标水平进行3平行实验，计算各添加水平下的回收率及相对标准偏差，见表3。在10 μg/kg添加水平下，各农药回收率67.2%～95.6%，相对标准偏差0.9%～18.2%；在20 μg/kg添加水平下，各农药回收率73.7%～95.6%，相对标准偏差0.6%～12.2%；在100 μg/kg添加水平下，各农药回收率83.0%～101.4%，相对标准偏差0.3%～8.4%；在200 μg/kg添加水平，各农药回收率90.2%～111.3%，相对标准偏差0.2%～3.3%。除杀螟硫磷在200 μg/kg回收率(111.3%)略高于GB/T 27404—2008[20]要求(0.2 mg/kg添加水平，80%～110%)外，其他农药在10～200 μg/kg添加水平下，均符合公告要求。该方法各农药定量为0.01 mg/kg，检出限小于0.001 mg/kg，能满足GB 2763—2019中大米中农药限量检测的要求，可应用于大米中限量农残的日常检测工作中。

表3 大米中25种农残及其代谢物加标回收率

2.4 大米实际样品的测定

采用开发的保护剂基质内标方法(GC-MS/MS)对15个市售的大米样品进行测试分析，农残检测结果见表4。除稻瘟灵、甲基嘧啶磷、三唑磷外，其他限量农残留均未检出，检出值远低于限量标准(GB 2763—2019)。

表4 市售大米样品中25种农残及其代谢物的测定

3 结论

基于气相色谱-三重四极杆质谱(GC-MS/MS)技术，建立了同时检测大米中25种农药及其代谢物残留的方法，样品经提取、盐析、净化，加保护剂，上机测定，操作简单，可批量处理，准确度和精密度满足方法学要求，方法的定量限低于食品安全标准大米中农药最大残留限量的要求，适用于批量大米样品中农药残留的日常定量分析，为保障我国大米质量安全提供参考。