脱酰胺对热诱导小麦面筋蛋白构象及凝胶性质的影响

时间：2024-07-28

王淑敏张鸿罗水忠李兴江赵妍嫣钟昔阳姜绍通郑志

(合肥工业大学食品科学与工程学院;安徽省农产品精深加工重点实验室，合肥 230009)

小麦面筋蛋白是一种营养均衡，食用安全的天然植物蛋白，具有来源广、成本低等特点。由于其良好的黏弹性、可降解性及成膜性，因而被广泛应用于焙烤食品、生物基础材料等领域［1－3］。小麦面筋蛋白是球蛋白结构，且对热敏感，高温热诱导处理会破坏其分子内或分子间相互作用，使位于蛋白质内部的疏水基团得以暴露，导致蛋白质变性或者聚集［4］。有报道称热诱导聚集体的形成降低了小麦面筋蛋白在披萨等焙烤食品中的加工性能［5］，因而对小麦面筋蛋白进行改性处理，以减少其热诱导聚集体，对于其加工应用具有重要意义。

蛋白质脱酰胺是通过将蛋白质中的酰胺基团转化为高疏水性的羧基，增加净负电荷数，从而改变蛋白质的结构并提升其溶解性及其它功能性质［6－7］。蛋白质脱酰胺的方法主要有化学法和酶法，采用酶法脱酰胺在温和性、高效性、安全性方面更具有优势［8－9］。目前可用于脱酰胺的酶有蛋白酶、蛋白质谷氨酰胺转氨酶、肽谷氨酰胺酶及蛋白质谷氨酰胺酶(PGase)。其中PGase已被用于米谷蛋白、玉米蛋白等食品蛋白质改性，研究发现PGase明显改善了米谷蛋白在弱酸性及中性条件下的溶解性［10］，也增加了玉米蛋白在中性条件下的乳化性［11］。小麦面筋蛋白中富含Gln残基，利用PGase处理小麦面筋蛋白，可以有效促使蛋白质结构伸展，并降低其致敏性［12］。先前关于PGase脱酰胺结合热诱导对乳清分离蛋白的影响研究表明，PGase处理后乳清分离蛋白的热诱导聚集体减少，且凝胶质地更加柔软［13］。尽管目前已有大量关于热诱导小麦面筋蛋白的报道［14－15］，但采用PGase进行热诱导前预处理，研究其对热诱导小麦面筋蛋白构象及凝胶性质影响的报道较少。

采用稀释的小麦面筋蛋白溶液研究PGase脱酰胺后热诱导处理对小麦面筋蛋白构象的影响，并利用质构仪、扫描电子显微镜等研究PGase处理小麦面筋蛋白热诱导凝胶样品凝胶性质及微观结构的变化，探讨其构象与凝胶性质之间的关系。以期拓宽小麦面筋蛋白的应用范围，为其高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦面筋蛋白:安徽瑞福祥食品有限公司;蛋白质谷氨酰胺酶(SD － C100S，EC 3.5.1.2):阿玛诺天野酶制剂商贸(上海)有限公司;去离子水为实验室采用Milli－Q净水系统进行自制;磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等化学试剂均为分析纯级:国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

Q200型差示扫描量热仪:美国Bio－Rad公司;Nicolet 67傅里叶红外光谱仪:美国热电公司;JSM－6490LV扫描电子显微镜:日本电子公司;TA－XT plus物性测定仪:美国Stable Micro System公司;SHIMADZU RF－5301 PC型荧光分光光度计:岛津(香港)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 未经热诱导处理及热诱导处理脱酰胺小麦面筋蛋白的制备

将小麦面筋蛋白溶于200 mM，pH=7.0的磷酸盐缓冲液配制成7%(m/V)的悬浊液，分别加入1、3、5、10 U/g的 PGase，于摇床中 40 ℃，110 r/min条件下脱酰胺反应1 h，随后立即冰浴冷却。为探究PGase脱酰胺随后热诱导处理对小麦面筋蛋白构象的影响，需制备未经热诱导处理及热诱导处理的脱酰胺小麦面筋蛋白样品。脱酰胺反应结束后，将样品分为两部分:一部分直接冷冻干燥，即得到未经热诱导处理的脱酰胺小麦面筋蛋白样品，分别记为DWG －1、DWG －3、DWG －5、DWG －10;另一部分置于90℃水浴加热40 min，随后冰浴冷却，冻干后得到热诱导处理的脱酰胺小麦面筋蛋白样品，分别记为HDWG －1、HDWG －3、HDWG －5、HDWG －10。未处理及只经过热诱导处理的小麦面筋蛋白分别记为WG、HWG，作为对照。

1.3.2 PGase脱酰胺小麦面筋蛋白热诱导凝胶的制备

脱酰胺小麦面筋蛋白热诱导凝胶是采用12%的小麦面筋蛋白悬浊液制备得到。将小麦面筋蛋白加入去离子水中，搅拌30 min分别加入1、3、5、10 U/g的PGase，脱酰胺及热诱导处理同1.3.1所述，随后立即冰浴冷却，即得到脱酰胺小麦面筋蛋白热诱导凝胶样品，分别记为 gel－1，gel－3，gel－5，gel－10，未加入PGase相同条件下制备的小麦面筋蛋白热诱导凝胶记为ck。凝胶样品于4℃冰箱过夜后用于凝胶性质测定。

1.4 分析方法

1.4.1 脱酰胺度测定

脱酰胺度用脱酰胺反应过程中产生氨的量与小麦面筋蛋白完全脱酰胺产生氨的量之比来表示，其中氨含量的测定采用康威氏扩散皿法［16］。

1.4.2 内源性荧光光谱分析

将DWG及HDWG样品分别溶于200 mM，pH=8.2的磷酸盐缓冲液，配制成5 mg/mL的悬浊液，于25℃，8000 r/min离心10 min，取50μL上清液于石英比色皿中，使用荧光分光光度计测定在激发波长为295 nm时，样品蛋白在320－460 nm范围内的荧光发射光谱。

1.4.3 红外光谱分析

采用傅里叶变换衰减全反射红外光谱法测定DWG及HDWG样品中各二级结构含量。在Nicolet 67傅里叶红外光谱仪中对样品进行32次全波段扫描(400～4 000 cm－1)，选择图谱中1 600～1 700 cm－1的酰胺 I带区域进行分析，依据 Wang等［17］对酰胺Ⅰ带各二级结构的区域划分，计算出二级结构含量。

1.4.4 热特性分析

准确称取3～5 mg DWG及HDWG样品于铝盘中，压盘，以空盘为对照，采用TA－Q200－DSC以10℃/min的升温速率在20～100℃之间进行热扫描，氮气流速为50 mL/min，变性温度和变性焓由DSC自带软件进行分析。

1.4.5 凝胶强度

采用TA－XT plus物性测定仪测定小麦面筋蛋白凝胶样品的凝胶强度，测定参数为:测前速度5 mm/s;测中速度2 mm/s;测后速度5 mm/s;目标深度为10 mm;探头对凝胶按压变形时所产生的最大破坏力作为凝胶强度。

1.4.6 保水性

小麦面筋蛋白凝胶样品的保水性测定参照Cao等［18］的方法。取3 g样品切成4 mm×4 mm×4 mm的小块，置于离心管中，于8000 r/min离心20 min，用滤纸将离心出来的水分吸除，再次称重。保水性(WHC)计算公式:

式中:W1为离心前凝胶样品的质量/g;W2为移除水分后凝胶样品的质量/g。

1.4.7 非可冻结水含量

总含水量(Wt)测定:参照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》中直接干燥法。

可冻结水含量(Wf)测定:参照Chen等人［19］的方法。取3～5 mg小麦面筋蛋白凝胶样品于铝盘中，压盘，以空盘作对照，热扫描以10℃/min的升温速率从－50℃升至60℃，氮气流速50 mL/min，变性焓由DSC自带软件进行分析。可冻结水含量为每克湿凝胶样品的变性焓与纯水变性焓(334 J/g)的比值。非可冻结水含量(Wnf)计算公式:

1.4.8 微观形貌观察

将小麦面筋蛋白凝胶样品切成3 mm×3 mm×1 mm的小块，经冻干后进行喷金处理，采用扫描电子显微镜在25 KV的加速电压下观察其微观结构。

1.5 数据统计分析

所有实验均进行至少三次重复，数据以平均值±标准差表示;采用SPSS软件进行显著性(P＜0.05)分析，通过Origin Pro 2016软件作图。

2 结果与分析

2.1 小麦面筋蛋白PGase脱酰胺处理

为研究PGase对小麦面筋蛋白的影响，测定了不同酶添加量时DWG样品的脱酰胺度(DD)及水解度(DH)，结果如表1所示。DWG样品的DD和DH值均随着酶添加量的增加而增加;但相比于脱酰胺度，水解度增加较缓慢，且处于较低水平(＜2%)。有报道称PGase处理会促使蛋白质发生水解反应［20］:一方面脱酰胺反应将Gln转化为Glu，分子内静电斥力增加，导致蛋白质分子裂解。另一方面脱酰胺导致蛋白质分子伸展，从而释放一些小肽片段。这与 Suppavorasatit等［9］的结果一致，在 PGase脱酰胺反应的同时伴随着较小程度的水解反应发生。

表1 PGase处理小麦面筋蛋白样品脱酰胺度和水解度的变化

2.2 PGase脱酰胺与热诱导处理对小麦面筋蛋白构象的影响

2.2.1 内源性荧光光谱分析

色氨酸、酪氨酸等氨基酸能够发射荧光，通过分析DWG和HDWG样品内源性荧光曲线，可以表征小麦面筋蛋白氨基酸微环境及结构的变化［21］。由图1可知，随着酶添加量增加，DWG样品的荧光强度(FI)显著增加，其中DWG－10的FI值是WG的3.5倍。这是由于PGase处理后负电荷增多，分子内或间静电斥力增加导致蛋白质结构伸展，暴露出更多的色氨酸残基至亲水环境中，因而蛋白质色氨酸微环境极性增加。HDWG样品的 FI值变化趋势与DWG样品相同，不同的是，热诱导处理后脱酰胺小麦面筋蛋白的FI值减小，这可能是由于热诱导处理导致小麦面筋蛋白发生热变性聚集［13］。随着酶添加量增加，DWG和HDWG样品的最大发射波长(λmax)均未发生明显的变化。但与DWG样品相比，HDWG样品的λmax发生红移，表明热诱导处理使小麦面筋蛋白结构发生了改变。

图1 脱酰胺及热诱导处理小麦面筋蛋白样品内源性荧光光谱

2.2.2 傅里叶红外光谱分析

傅里叶红外光谱(FTIR)可以表征蛋白质的构象，其中酰胺Ⅰ带(1 600～1 700 cm－1)是分析蛋白质二级结构最灵敏的区域。DWG及HDWG样品二级结构含量如图2所示，可以看出小麦面筋蛋白二级结构主要由β–折叠组成。随着PGase添加量增加，DWG样品α–螺旋和β–转角结构含量增加，而β–折叠结构含量降低。有报道称β–折叠结构相对稳定，而α–螺旋、β–转角和无规则卷曲结构比较灵活［22］，表明PGase处理使小麦面筋蛋白结构灵活性增加。另外Glu是组成β–转角结构的主要成分，随着脱酰胺反应产生更多的Glu，DWG样品β－转角结构含量增加。与 WG相比，HWG样品α－螺旋结构含量减少，β－折叠结构含量增加，这归因于小麦面筋蛋白的热诱导聚集。杨芳［23］在对豆腐凝胶形成机理的研究中提到，分子间β－折叠结构与蛋白聚集体的形成有关。在图2a中 DWG样品β－折叠结构含量降低，表明脱酰胺处理后蛋白质聚集体减少;同时HDWG样品的β－折叠结构含量也具有同样的变化趋势，即随着酶添加量的增加而减少，且通过比较发现DWG样品的β－折叠结构含量较HDWG样品稍低，从而表明PGase处理在一定程度上能够抑制小麦面筋蛋白热变性聚集。此外，我们通过分析α－螺旋与β－折叠结构含量的比值(数据未给出)的变化，也得出了相同的结论。

2.2.3 热特性分析

DSC图谱中变性温度Td和热焓值ΔH能够反映蛋白质变性状态:ΔH能够表示蛋白质结构的有序程度，ΔH值越大，则蛋白质结构更加有序;Td能够表示蛋白质聚合程度，Td值越大，则蛋白质结构更加紧密［24］。DWG和HDWG样品的DSC图谱及热特性参数如图3和表2所示。由图3可知，DWG和HDWG样品均呈现向上的吸热峰，表明小麦面筋蛋白变性是一个吸热过程。在表2中，随PGase添加量增加，DWG样品Td值先降低后增加，说明PGase处理后小麦面筋蛋白结构伸展，但并不会发生持续伸展，当达到一定的DD后又有所聚集;这可能是由于蛋白质伸展过程中疏水区域的暴露，导致疏水相互作用增加，促使蛋白分子聚集。与WG相比，HWG样品Td值增大，表明小麦面筋蛋白发生热变性聚集;而ΔH值则显著降低，说明热诱导处理后其蛋白结构变得更加无序。与HWG相比，HDWG样品Td值随着酶添加量的增加而降低，而ΔH值则持续增大，说明脱酰胺能够抑制小麦面筋蛋白的热诱导聚集行为，使蛋白质结构更加有序。

图2 DWG样品及HDWG样品二级结构含量的变化

表2 脱酰胺及热诱导处理小麦面筋蛋白样品的热特性参数

图3 脱酰胺及热诱导处理小麦面筋蛋白样品DSC图谱

2.3 PGase脱酰胺对小麦面筋蛋白热诱导凝胶的影响

2.3.1 凝胶强度和保水性分析

凝胶强度和保水性是两个重要的凝胶特性，能够反映凝胶体系中蛋白质与水之间相互作用［25］。小麦面筋蛋白凝胶样品的凝胶强度和保水性如图4所示，可以看出随着PGase添加量增加，小麦面筋蛋白凝胶样品的凝胶强度和保水性呈现先增大后减小的趋势，但均明显高于相应对照组，表明PGase改性有助于提高小麦面筋蛋白热诱导凝胶的凝胶性质;其中gel－3的凝胶强度和保水性均最大，分别为903.27 N和78.70%。一方面PGase处理后小麦面筋蛋白结构伸展，暴露出更多的疏水残基，而后疏水相互作用导致蛋白结构重排，从而形成更加均匀有序的凝胶网络;另外脱酰胺反应导致Glu残基增多，同时蛋白分子内静电斥力及亲水区域也增加，从而凝胶强度和保水性增加。酶添加量继续增多，凝胶强度和保水性反而稍有降低，这可能是由于更多的酶添加量、更大的脱酰胺程度导致蛋白质分子聚集，从而进一步影响了其凝胶样品的凝胶性质。这说明PGase能够一定程度上抑制小麦面筋蛋白的热变性聚集。

图4 脱酰胺小麦面筋蛋白热诱导凝胶样品凝胶强度和保水性的变化

2.3.2 非可冻结水含量分析

在蛋白质凝胶中，凝胶网络－水相互作用能够对其结构及功能产生显著影响，从而对于决定和维持蛋白质三维网络结构至关重要。有报道将凝胶中的水分为非可冻结水及可冻结水(包括可冻结结合水、自由水)两类，并认为水分分布会显著影响凝胶的质构及稳定性［26］。如图5所示，随着PGase添加量增加，小麦面筋蛋白凝胶样品中冻结水含量降低，非可冻结水含量相应增加;这是由于PGase改性后较高的电荷密度使得可冻结水与肽链相互作用增加，转换为非可冻结水;另外PGase处理后，蛋白质与水结合能力增加，导致小麦面筋蛋白凝胶网络持水性增大，亲水基团相互作用也促使更多的非可冻结水形成。此外，小麦面筋蛋白凝胶样品中总水含量与非可冻结水含量变化一致，也随着酶添加量的增大而增加。有报道称凝胶样品中较高的总水含量及非可冻结水含量一般与其较高的保水性有关［19］，在本研究中当酶添加量为5 U/g时，总含水量及非可冻结水含量更高，其中gel－5中非可冻结水含量为19.56%，是对照组的2倍。

图5 脱酰胺小麦面筋蛋白热诱导凝胶样品水分分布

2.3.3 微观结构分析

脱酰胺小麦面筋蛋白热诱导凝胶样品的微观形貌如图6所示。由图6可知，未经脱酰胺改性的小麦面筋蛋白热诱导凝胶的结构孔径较大，且分布不均，呈海绵状结构。随着PGase添加量增加，小麦面筋蛋白凝胶样品孔径减小，形成了多孔且更加有序的网状结构;这与Cao等［18］的测定结果相一致，较高的非可冻结水含量对应着更高凝胶强度且更紧密结构的凝胶网络，这对于小麦面筋蛋白凝胶产品的生产提供了依据。

图6 脱酰胺小麦面筋蛋白热诱导凝胶样品的扫描电子显微镜图(×250)