预处理对大豆分离蛋白结构及凝胶性质的影响

汪长青 李兴江 穆冬冬 罗水忠 赵妍嫣 钟昔阳 姜绍通 郑 志

(合肥工业大学食品科学与工程学院;安徽省农产品精深加工重点实验室，合肥 230009)

大豆分离蛋白是大豆的重要组分，是以低温脱脂大豆粕为原料生产的一种蛋白质含量高达90%以上的混合物，已被广泛应用于食品及其他行业中［1－2］。凝胶性是大豆分离蛋白重要的功能特性之一，直接影响大豆食品如豆腐、腐乳等的外形、口感和质地［3－4］。

大豆分离蛋白凝胶的形成受多种因素如加热、凝固剂、交联剂、酶等影响。酶法制备大豆蛋白凝胶中TG酶研究较多，TG酶可催化蛋白质及肽键中谷氨酰胺残基的γ－羟基酰胺基和赖氨酸上ε－氨基之间的酰胺基转移反应，形成ε－(γ－谷氨酰胺)赖氨酸共价键，导致蛋白质或多肽间发生共价交联形成凝胶［5］。由于SPI蛋白的球状结构，包埋了大量反应位点，不利于TG酶交联。因此，对SPI蛋白进行预处理，促使蛋白结构展开，TG酶底物暴露成为本文研究要点。目前，对蛋白预处理方法主要集中在物理、化学和酶法方面［6］。Jambrak 等［7－8］研究显示，超声波的空化作用使得乳清蛋白和大豆蛋白的结构展开，肽键断裂，蛋白质分子质量减小。Zhang等［9］对花生分离蛋白进行超声波处理，提高了其溶解性及乳化性。Qin等［10］用微波处理大豆和小麦蛋白混合溶液，提高了蛋白的溶解性和游离巯基含量，促进了其TG酶促凝胶性能。孙撬撬等［11］对小麦蛋白进行亚硫酸钠和超声波复合预处理，提高了蛋白溶解性，促使二硫键还原，蛋白结构松散。王飞镝等［12］通过添加乙醇增强了分子间氢键作用，影响了分子结构，从而增强了大豆蛋白凝胶的抗宏观变形能力及吸水能力。

本实验拟采用添加亚硫酸钠、乙醇，以及超声波和微波对SPI蛋白进行理化预处理，对比分析不同预处理方法前后SPI蛋白溶解度和结构的变化，在此基础上，利用TG酶促进SPI蛋白形成凝胶，研究其凝胶强度及微观结构。研究结果可为提高SPI蛋白的凝胶性，促进SPI蛋白在食品领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白(蛋白质含量≥90%):河南省鲲华生物技术有限公司;TG酶(酶活力为1 000 U/g):泰州市一鸣生物制品有限公司。

氢氧化钠、亚硫酸钠、乙醇:国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

721 G型可见分光光度计:上海精科仪器有限公司;JJ－1型数显电动搅拌器:江苏金坛市金城国胜实验仪器厂;TA－XT plus型质构仪:英国Stable Micro System公司;MS－2000型激光粒度分析仪:英国Malvern公司;FC型全波长扫描酶标仪:美国Thermo Fisher公司;SB－5200DT型超声波清洗机:宁波新芝生物科技股份有限公司;WP700TL23－K1型微波炉:佛山格兰仕微波炉电器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 SPI的预处理

亚硫酸钠预处理:预实验确定了亚硫酸钠浓度为800 mg/L、预处理时间为0.5 h时SPI蛋白溶解度最大。将0.08 g亚硫酸钠溶解到100 mL水中，匀速搅拌，加入10 g SPI，在室温、pH为7.0的条件下连续搅拌0.5 h，真空冷冻干燥得到预处理的SPI蛋白样品。预处理样品用于粒径、表面疏水性、化学作用力及二级结构的检测。

乙醇预处理:预实验确定了乙醇体积浓度为1%、预处理时间为1 h时SPI蛋白溶解度最大。配制1%的乙醇溶液，匀速搅拌，加入10 g SPI，在室温、pH为7.0的条件下连续搅拌1 h，真空冷冻干燥得到预处理的SPI蛋白样品。预处理样品用于粒径、表面疏水性、化学作用力及二级结构的检测。

超声预处理:预实验确定了超声时间为1.5 h时SPI蛋白溶解度最大。配制10 g/100 mL的SPI溶液，在室温、pH为7.0的条件下连续搅拌0.5 h后放置于超声处理装置中(40 kHz，300 W)1.5 h，真空冷冻干燥得到预处理的SPI蛋白样品。预处理样品用于粒径、表面疏水性、化学作用力及二级结构的检测。

微波预处理:预实验确定了微波功率为700 W、预处理时间为1 min时SPI蛋白溶解度最大。配制10 g/100 mL的SPI溶液，在室温、pH为7.0的条件下连续搅拌0.5 h后进行微波预处理(3.0 GHz，700 W)，处理时间为1 min，真空冷冻干燥得到预处理的SPI蛋白样品。预处理样品用于粒径、表面疏水性、化学作用力及二级结构的检测。

1.3.2 TG 酶交联制备 SPI凝胶

在预处理后的SPI蛋白溶液中，边搅拌边加入TG酶，加酶量均为40 U/g蛋白，混匀，水浴40℃反应40 min，90℃灭酶10 min，立即冰浴冷却，将所得凝胶置于4℃冰箱中过夜保存，以未经预处理的SPI蛋白凝胶作对照，进行凝胶强度、持水性和扫描电子显微镜(SEM)的检测。

1.4 分析方法

1.4.1 溶解度的测定

依据Sun等［13］的测定方法，略有改动。将预处理样品配成浓度为10 mg/mL的水溶液，在室温下用磁力搅拌器搅拌1 h，4℃下8 000 r/min离心20 min，上清液中可溶性蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。

1.4.2 粒径的测定

参考Arzeni等［14］所述，将预处理样品分散于去离子水(10.0%，0.1 g/10 mL水)中并在25℃下搅拌0.5 h。使用Mastersizer 2000激光粒度分析仪通过激光散射测定样品的粒度。参数分别设定为泵速1 800 r/min、折射率1.333 和吸收 0.001。粒径测定的数值为表面积平均直径(D32)和体积平均直径(D43)。

1.4.3 游离巯基的测定

依据Shimada等［15］测定方法，略有改动。配制pH=8.0 的 Tris－ Gly缓冲液(0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L Glycine 和4 mmol/L Na2EDTA)和4 mg/mL DTNB溶液(Ellman试剂)。取预处理样品溶解在Tris－Gly缓冲液中(0.1 g样品/5 mL Tris－Gly缓冲液)，在25℃水浴中反应24 h，8 000 r/min离心20 min，取3 mL上清液中加入0.03 mL DTNB溶液混合均匀，反应15 min后在412 nm处测定吸光度，以缓冲液为对照。按公式计算:

式中:1.36×104为Ellman试剂的摩尔消光系数;A412为412 nm处的吸光值;D为稀释系数;C为样品最终浓度/mg/mL。

1.4.4 表面疏水性的测定

根据Hayakawa等［16］的方法，使用 ANS作为荧光探针来测量样品的表面疏水性。用磷酸盐缓冲液稀释预处理样品(1 mg/mL溶解于0.01 mol/L pH=7缓冲液中)，8 000 r/min离心20 min。将上清液中的蛋白质浓度以0.1～0.000 5 mg/mL的梯度稀释。然后，向3 mL稀释的样品中加入60μL ANS(溶解在8.0 mmol/L磷酸盐缓冲液中)，并使用全波长扫描酶标仪的荧光模式来测定相对荧光强度，测定参数为激发波长365 nm和发射波长484 nm。表面疏水性值为相对荧光强度比蛋白质浓度的初始斜率。

1.4.5 分子间作用力的测定

参考 Gómez－Guillén 等［17］所述的方法并稍作修改。用于溶解预处理样品的缓冲液如下:(1)0.05 mol/L的NaCl溶液(PA);(2)0.6 mol/L的 NaCl溶液(PB);(3)0.6 mol/L 的 NaCl溶液 +1.5 mol/L 的尿素(PC);(4)0.6 mol/L的NaCl溶液+8 mol/L的尿素(PD)。取0.3 g冻干的SPI样品，分别溶解于5 mL上述缓冲液中并混合均匀，4℃条件下静置1 h，10 000 r/min离心20 min，上清液的蛋白含量由考马斯亮蓝法测得。离子键的贡献以溶解于PB和PA中SPI含量之差表示，氢键贡献以溶解于PC和PB中SPI含量之差表示，疏水相互作用贡献以溶解于PD和PC中的SPI含量之差表示。

1.4.6 傅里叶红外光谱分析

FTIR光谱分析使用配备有氘化硫酸三甘氨酸附件的傅里叶红外光谱仪来进行测量［18］。取0.1 g预处理样品，按1∶99的比例加入KBr中，使用玛瑙研钵将样品混合，并使用液压机压制形成1～2 mm的薄片。置于氘化硫酸三甘氨酸附件上，在4 000 cm－1至400 cm－1的测定全波段下以4 cm－1的分辨率进行总共64次扫描。使用Omnic 6.0软件和PeakFit 4.12软件进行1 600至1 700 cm－1的酰胺I带图谱中的二级结构变化进行分析。先校正基线，然后经过去卷积和二阶导数拟合。根据峰面积计算各二级结构的比率。

1.4.7 凝胶强度的测定

将1.3.2节制备的凝胶样品取出后放置30 min。采用质构仪穿刺实验法测凝胶强度［19］。

25℃下采用质构仪测定改性大豆蛋白的凝胶强度，穿刺实验操作条件:P0.5探头，测试前速度:5.0 mm/s，测试速度:2.0 mm/s，测试后速度:10.0 mm/s，出发力10 g，下压凝胶10 mm所需力为凝胶强度，单位g/cm2。

1.4.8 凝胶样品持水率的测定

根据 Tang等［20］测定方法，按照 1.3.1 中得到的凝胶样品取5 g用于WHC的测量。将凝胶样品置于10 mL离心管中，以8 000 r/min在4℃下离心20 min。离心后，除去水并精确称量带有样品的离心管。WHC计算方法:

式中:W t为凝胶样品中所含水分的总质量/g;W r为离心后凝胶溢出水分的质量/g。

1.4.9 微观结构观察

依据Chin等［21］测定方法，将冻干的凝胶样品置于氩气环境下进行粘板，临界点干燥，离子溅射，和喷金处理。然后将喷金处理后的样品在10 kV加速电压下的扫描电子显微镜进行测量，并观测记录预处理对TG酶诱导的SPI蛋白凝胶的微观形态结构。

1.5 数据处理

所有的实验进行三次重复，数据以平均值±标准差的形式表示。数据的显著性(P＜0.05)通过SPSS软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 预处理对大豆分离蛋白溶解度的影响

溶解度的变化一定程度上能反应蛋白质结构的变化，是蛋白质的重要特征。亚硫酸钠预处理(浓度为800 mg/L、预处理时间为0.5 h)、乙醇预处理(体积浓度为1%、预处理时间为1 h)、超声波预处理(40 kHz，300 W，1.5 h)、微波预处理(700 W，1 min)对SPI可溶性蛋白含量的影响如图1所示。

图1 预处理对大豆分离蛋白溶解度的影响

由图1可知，预处理能显著提高大豆分离蛋白的溶解性。微波预处理使可溶性蛋白含量由2.95 mg/mL提升为5.30 mg/mL。亚硫酸钠是一种还原剂，可以还原蛋白分子间和分子内的二硫键，使蛋白分子中的二硫键部分断裂形成游离巯基，从而破坏其三级结构，使溶解性增强［22］。超声波的空化效应和机械效应等作用使大颗粒的蛋白聚集体解聚成较小颗粒的蛋白分子，蛋白质颗粒体积的减小，从而使蛋白质更易分散在水中［23］。微波通过对蛋白质中极性分子在水中强电场强度的高频率振荡作用，使微波场能转化为热能导致蛋白质温度升高，从而断裂蛋白质分子间和分子内的共价键和非共价键，例如二硫键和氢键，从而导致蛋白质结构的疏散展开，改善了蛋白质的溶解性［24］。低浓度醇类的添加降低了水介质的介电常数，提高了蛋白质分子内和分子间的静电作用力，能在一定程度上能影响蛋白质分子结构的展开，然而对大豆分离蛋白的溶解性提升并不明显［12］。

2.2 预处理对大豆分离蛋白粒径的影响

不同理化预处理后的SPI蛋白的粒度分布和粒径大小如图2和图3所示。

图2 预处理对大豆分离蛋白粒径分布的影响

图3 预处理对大豆分离蛋白粒径的影响

由图2、图3可知，亚硫酸钠、超声波和微波预处理使大豆分离蛋白的表面积平均粒径(D32)和体积平均粒径(D43)都显著降低。微波预处理对粒径改变效果最明显，使D32从169.43μm降至108.17 μm，D43从324.79 μm 降至222.24 μm。亚硫酸钠还原了蛋白质中的二硫键，使其粒径减小。超声波可能通过空穴效应使溶液形成湍流，湍流产生的机械剪切力将蛋白颗粒打散，使蛋白质的粒径减小。微波使粒径减小可能是通过还原二硫键、减小氢键作用等使蛋白断裂展开所致。乙醇预处理对粒径的改变并不明显。预处理对粒径的改变与溶解度的结果类似，说明SPI的溶解性与粒径有一定的关系。

2.3 预处理对大豆分离蛋白游离巯基的影响

根据含游离巯基的蛋白质易与Ellman试剂发生反应的原理，测定游离巯基含量。游离巯基的含量在SPI蛋白结构中起重要作用。不同理化预处理对SPI溶液中游离巯基含量的影响如图4所示。

图4 预处理对大豆分离蛋白游离巯基含量的影响

由图4可以看出，亚硫酸钠预处理对可溶性大豆蛋白的游离SH含量的提升很显著，含量由5.44 μmol/g提升为17.93μmol/g，验证了亚硫酸钠对蛋白二硫键的还原作用，使游离SH含量增大。超声波和微波预处理对游离SH含量也有明显提升，可能是由于超声波空化现象的高压、剪切力和湍流力使得蛋白质内二硫键发生断裂。微波处理会产生极化现象，可以使二硫键断裂以形成游离SH基团。乙醇预处理并没有明显改变SPI的游离SH含量。经过预处理的SPI，游离SH含量上升，二硫键含量下降，可能导致蛋白分子展开，从而影响到蛋白颗粒的粒径与溶解性。

图5 预处理对大豆分离蛋白表面疏水性的影响

2.4 预处理对大豆分离蛋白表面疏水性的影响

表面疏水性(H0)不仅在研究蛋白质的稳定性、构象和分子间相互作用中具有重要作用，而且在凝胶网络的形成中也起到一定的作用［25］。

由图5可知，亚硫酸钠、超声波和微波预处理能显著提高可溶性大豆蛋白的H0。超声波预处理使蛋白H0从72.39升至115，提升效果最为显著。亚硫酸钠通过破坏蛋白二硫键从而使内部疏水基团暴露到表面，提升了H0。超声波的空化现象会使蛋白质分子展开和分散，疏水基团暴露到表面。微波处理的热效应使蛋白质分子展开，蛋白质的变性暴露了疏水基团［26］。乙醇预处理没有明显改变蛋白的H0。

2.5 预处理对大豆分离蛋白分子间作用力的影响

通过测定SPI在四种溶剂中的溶解度，来表征预处理引起的蛋白质分子间作用力，测定结果如图6所示。

图6 预处理对大豆分离蛋白分子间作用力的影响

维持蛋白质结构的化学键主要有离子键、氢键、疏水相互作用和二硫键等。不同化学试剂对大豆分离蛋白具有破坏特定形式化学键的能力，根据大豆分离蛋白在几种不同化学试剂中溶解度的不同，测定了预处理后大豆分离蛋白化学键的变化［27］。由图6可知，亚硫酸钠预处理可使离子键作用增强，可能是由于盐离子的引入。乙醇预处理使氢键作用显著提升，可能是由于极性溶剂乙醇可通过羟基与蛋白质分子形成氢键所致［28］。图6还可以发现，疏水相互作用对于维持SPI蛋白结构所起的作用较大。亚硫酸钠、微波和超声波预处理使疏水相互作用显著降低，可能是由于预处理使蛋白质分子展开，破坏了疏水相互作用。

2.6 预处理对大豆分离蛋白二级结构的影响

FTIR分析用于说明蛋白质构象的变化。FTIR光谱的酰胺Ⅰ带光谱(1 600～1 700 cm－1)主要来源于多肽链中蛋白质二级结构C=O键的弯曲振荡，被广泛应用于蛋白质二级结构的研究中。吸收峰与二级结构关系如下:α－螺旋为1 650～1 660 cm－1;β－折叠为1 610～1 640 cm－1和1 670～1 690 cm－1;β －转角为1 660～1 670 cm－1和1 690～1 700 cm－1;和无规则卷曲为1 640 ～1 650 cm－1［29］。

表1 预处理对大豆分离蛋白二级结构的影响

蛋白质分子内多肽链可形成α－螺旋、β－折叠、β－转角等特定的立体结构，这些结构的变化可反映蛋白二级结构的变化。如表1所示，亚硫酸钠预处理对二级结构的改变程度并不大，其导致的蛋白质β－折叠的减少和无规则卷曲的增加可能是由于亚硫酸钠使蛋白中的二硫键断裂所引起的变化。乙醇预处理使α－螺旋增加、无规则卷曲减少，可能是由于极性溶剂乙醇可通过羟基与蛋白质分子形成氢键，增强氢键作用力所致。超声波和微波预处理使α－螺旋显著降低、无规则卷曲显著上升，可能是破坏了维持α－螺旋的氢键，分子无序结构增加，微波预处理改变更为明显。

2.7 预处理对TG酶改性大豆分离蛋白凝胶性质的影响

凝胶强度和持水性(WHC)是凝胶的两个重要性质，反应了凝胶体系中蛋白质和水的相互作用能力。经过理化预处理后，TG酶的交联作用使SPI形成凝胶，不同预处理方式对SPI凝胶凝胶强度和WHC的影响如图7所示。

如图7所示，预处理后形成凝胶的凝胶强度和WHC要显著高于未处理样品。微波预处理的SPI凝胶具有最高的凝胶强度和WHC。亚硫酸钠、超声波和微波预处理均使蛋白质粒径分子减小，这利于形成紧凑和均匀的凝胶网络，而紧密且均匀的结构可以束缚住凝胶体系中的水，从而导致凝胶强度和WHC。此外，这三种处理方式均使蛋白溶解性增强，表面疏水基团和无序结构增加，分子展开，TG酶反应位点增加，这些都利于凝胶强度和WHC的增强。乙醇主要是靠增强氢键作用促进凝胶强度和WHC。

2.8 微观结构分析

SEM图用来表示不同预处理对TG酶诱导的SPI蛋白凝胶的三维网络微观结构的影响。图8显示出在不同理化预处理方法下TG酶诱导的SPI蛋白凝胶的一组微观结构图像。

图8 预处理TG酶改性大豆分离蛋白凝胶的SEM图

大豆分离蛋白凝胶性质与其微观结构密切相关。如图8所示，未经处理的凝胶具有孔洞较大、交联度较低且不规则的粗糙网络结构，而预处理后的凝胶具有更为均匀且交联度较高的网络结构。

3 结论

物理预处理能够显著降低SPI蛋白的平均粒径，使SPI蛋白溶解性增加，能够引起部分蛋白质结构展开，二级结构发生改变。而亚硫酸钠预处理主要通过还原二硫键引起蛋白质结构的改变，乙醇预处理显著提高了蛋白间的氢键作用力。

预处理可以促进SPI蛋白形成TG改性凝胶，这是由于预处理使蛋白颗粒变小，溶解性增加，二硫键断裂，疏水基团暴露，结构展开，构象改变。导致TG酶的反应位点暴露，增加了酶与底物结合机率，促进了蛋白质分子间的交联，从而形成均匀致密的凝胶网络，使凝胶强度和持水性增加。其中以微波预处理的SPI蛋白凝胶效果最好。