山楂籽油化学成分及抗氧化活性的研究

王 芳 张 雅 李 婕 王四旺

(西安思源学院1，西安 710032)

(第四军医大学2，西安 710032)

山楂(Hawthorn)，别名红果、山楂果、山里红，为蔷薇科植物山里红Crataegus pinnatifida Bge var major N.E.Br或山楂 Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实，味酸、甘，微温，归脾、胃、肝经［1］。《本草纲目》记载“山楂性酸甘、微温”“长于化饮食、健脾胃、行结气、消淤血”，为我国特有的果树，已有3 000多年的栽培历史［2］。山楂中含有黄酮、萜类、鞣质等多种化学成分［3－4］，可以软化血管、降低血清胆固醇、抗氧化、助消化、抗菌，对冠心病和高血压等多种疾病有很好的疗效［5－7］。

山楂籽约占山楂总重的1/3，经初步研究，它所含的各种成分与果肉差不多，同样具有显著降低血清中的胆固醇，抗氧化等功能［8－9］。我国每年至少收购15亿kg山楂，其中约5 000万kg的核弃为废物。如何对山楂核进行综合利用，变废为宝，发挥其经济效益，是我们现在的当务之急。有研究表明，山楂籽出油率高(10%以上)，可以降低胆固醇和甘油三脂［10］。并且有很好的体内抗氧化活性［11］。根据目前研究表明，氧化应激是很多疾病的发病因素之一，抗氧化剂在许多疾病的预防方面有重要作用［12－13］。那么具有好的抗氧化性的山楂籽油是否能作为功能性植物油开发，这些需要我们进一步研究。

刘洪民等［14］研究了用CO2超临界萃取方法提取山楂籽油的条件，并初步研究了山楂籽油的化学成分，为山楂籽油的研究奠定了的基础。目前工业榨油多选用传统的压榨法，前期用传统压榨法榨取了山楂籽油，并进行了初步研究，结果显示，压榨法制得的山楂籽油物理化学性质基本与文献［14］研究相同，重金属含量符合国家食用油安全标准(GB 2716—2005)。为了进一步阐明山楂籽油的构效机制，本实验研究了山楂籽油的化学成分、脂肪酸组成、并建立了可靠的方法测定油中主要抗氧化活性物质角鲨烯，4种构型的维生素E、总黄酮以及总多酚含量，所建立的方法简单、可靠。并进一步研究了山楂籽油的体外抗氧化活性，为山楂籽油作为功能性食用油的开发及利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果实产自河南，取出山楂核后洗净晾干，委托杨凌飘香食用油有限公司以压榨法进行提取。共制备3批，把3批样品混匀，避光保存。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂

角鲨烯、DPPH(1，1－二苯基－2－三硝基苯肼)(CASD913－2)、ABTS(2'－联氨 －双 －3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸)(CAS 30931－67－0)、37 component FAMEs mixture(LOT XA10868V)、维生素E标准品α－生育酚(LOT LC14119V)、!－生育酚(LOT LC14601V)、γ－生育酚(LOT LC12728V)、δ－生育酚(LOT LC13568V)、维生素 C(CAS50－81－7)、福林酚试剂(CAS F－9252)、芦丁(批号:100080－200707)、没食子酸(批号:110831－201204)、正三十二烷(CAS 544－85－4):均为色谱纯;甲醇(色谱纯)、注射用水(制水机:milli－Q Advantage)自制;其余试剂均为分析纯。

1.2.2 主要仪器

ISQ 110953 GC－MSsystem;LC－15C液相色谱仪;紫外－可见光分光光度计UV 2600;DZKW－D－1电热恒温水浴锅;PS－08超声波清洗器。

1.3 方法

1.3.1 化学成分

山楂籽油用正己烷(色谱级)稀释50倍，加入无水硫酸钠适量过夜。GC条件:DB－5MS column(30 m ×0.25 mm ×0.25μm):安捷伦科技有限公司(美国);恒定流量:1.0 mL/min;进样1 μL，载气为氦气(99.9%);初始温度:60℃，保持 3 min;以3℃/min升至300℃，保持5 min。分流比:100∶1;进样口、传输线、离子源温度分别为300、300、280℃。MS条件:电子能量70 eV、EI离子源、发射电流200 μA、扫描范围20～550 amu。

1.3.2 脂肪酸组成

山楂籽油根据标准(ISO 5509:2000)进行样品处理。GC条件:GSBP－INOWAX－MScolumn(30 m×0.25 mm ×0.25 μm):GS－TEK(美国);恒定流量:1.5 mL/min;进样1 μL，载气为氦气(99.9%);初始温度:初始温度:50℃;以5℃/min升至230℃，保持18 min。分流比:10∶1，进样口、传输线、离子源温度分别为250、280、250℃。MS条件:电子能量70 eV、EI离子源、发射电流200μA、扫描范围20～550 amu。37 component FAMEs mixture标准品用正己烷(分析纯)稀释10倍，按照以上色谱条件进行分析，通过标准品及质谱数据库(NIST05库)，确定并计算脂肪酸种类及含量。

1.3.3 角鲨烯含量

山楂籽油根据标准(ISO 18609:2000)进行样品处理。GC条件:DB－5MS column(30 m×0.25 mm×0.25μm):安捷伦科技有限公司(美国);恒定流量:1.0 mL/min;进样1 μL，载气为氦气(99.9%);初始温度:180℃;以15℃/min升至260℃;以3℃/min升至280℃，保持2 min;以10℃/min升至200℃，保持3 min。分流比:10∶1;进样口、传输线、离子源温度分别为300、300、280℃。MS条件:电子能量70 eV、EI离子源、发射电流200μA、扫描范围20～550 amu。内标正三十二烷用正己烷(分析纯)稀释为1 g/L。角鲨烯标准品用正己烷(分析纯)分别稀释为一定浓度，按照以上色谱条件进行分析。

1.3.4 维生素E含量

山楂籽油根据标准(NY/T 1598—2008)进行样品处理。色谱条件:GS－120－5 C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm，Unimicrotech)(上海通微分析技术有限公司);流动相为甲醇∶水(98∶2)，流速为1 mL/min，柱温:30℃，检测波长为294 nm，进样量10μL。维生素E标准品处理:取适量α－生育酚、!－生育酚、γ－生育酚、δ－生育酚用甲醇(色谱纯)稀释成一定浓度，按照以上色谱条件进行分析。

1.3.5 总多酚、总黄酮含量

1.3.5.1 样品制备

取山楂籽油2 g，根据文献［15］进行样品的提取。

1.3.5.2 总多酚含量

按照文献［16］方法进行测定。检测波长为765 nm。样品的多酚含量用没食子酸当量表示(mg GAEs/100 g DW)。

1.3.5.3 总黄酮含量

按照文献［17］方法进行测定。检测波长为510 nm。样品的总黄酮含量用芦丁当量表示(mg REs/100 g DW)。

1.3.6 抗氧化活性的测定

1.3.6.1 对 DPPH 清除能力

取1.3.5.1 项下样品提取物 200 μL，加 3.8 mL DPPH溶液，避光反应30 min。利用紫外－可见分光光度计在波长517 nm处测定吸光度。按照公式1计算清除率。

1.3.6.2 对 ABTS 清除能力

分别配置7.00 mmol/L ABTS溶液及2.45 mmol/L过硫酸钾溶液，两溶液等比例混合，于冰箱中放置12～16 h，用无水乙醇稀释至吸光度大约为1.0左右(734 nm)。取样品提取物200μL，加3.8 mL ABTS混合溶液，避光反应6 min。利用紫外－可见分光光度计在波长734 nm处测定吸光度。按照公式1计算清除率。

式中:A0为空白对照的吸光度;Ai为样品对DPPH/ABTS作用后的吸光度;Aj为样品本身的吸光度

1.4 统计方法

各组实验数据用均数±标准差(X±S)表示，应用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 主要化学成分

对山楂籽油按照1.3.2所述方法进行了GCMS分析，经NIST05数据库检索，共鉴别出28种成分，初步确认了23种，占总峰面积的83.9%，总离子图见图1。各成分按照面积归一法计算，结果见表1。

由表1可知，山楂籽油中的低沸点成分是醛类，它们一般赋予了食品类的香气。在高沸点成分中，含量最高的是亚油酸、油酸及其脂类。除此之外，还含有很多具有生物活性的功能性成分，例如角鲨烯、维生素E、多羟基成分、植物甾醇、脂肪醇等。其中角鲨烯含量最高。角鲨烯的抗氧化能力已经得到公认［18］。除此之外，他还能降低血清胆固醇及甘油三酯［19］。维生素E有很好的抗氧化能力，而植物甾醇则有很好的预防心血管疾病的作用。由此可见，山楂籽油具有很高的药用价值。

图1 山楂籽油总离子流图

2.2 脂肪酸组成

本实验用37种脂肪酸标准品结合质谱数据库，共确定山楂籽油中含有14种脂肪酸(图2、表2)。其中不饱和脂肪酸(UFA)多于饱和脂肪酸(SFA)，而不饱和脂肪酸中，多不饱和脂肪酸(PUFA)多于单不饱和脂肪酸(MUFA)。主要脂肪酸为亚油酸、油酸和棕榈酸，占总峰面积的91%。

表1 山楂籽油化学成分

每种植物油的脂肪酸组成都不一样，好的脂肪酸组成代表着油具有高的价值。山楂籽油的SFA、MUFA、PUFA组成类似于大豆油、玉米油和葵花籽油［20］，但是UFA却比它们多。UFA不能在人体内合成，只能从外界摄取，而UFA可以降低血浆胆固醇，预防心血管疾病的发生［21－22］，并且增加胰岛素的敏感性［23］。因此，山楂籽油的脂肪酸组成更有利于人类的健康。

图2 脂肪酸总离子流图

表2 脂肪酸成分分析

2.3 山楂籽油中抗氧化成分含量及抗氧化活性的测定

2.3.1 角鲨烯含量

为了得到准确的角鲨烯含量，本实验按照1.3.3方法，对样品做了一定的纯化处理，使得本方法测定的角鲨烯及内标峰附近无干扰峰，测得的值更加准确(图3)。通过GC－MS测定，山楂籽油中含有角鲨烯(236.64 ±13.20)mg/kg(标准曲线 y=677 153.900 6x－238 091 4.669 6(R2=0.999 8)，高于很多植物油，例如油茶籽油(155.77 mg/kg)、苦瓜籽油(129.5 mg/kg)、葵花籽油(80.56 mg/kg)［20］等。对其方法学进行研究，精密度(RSD 0.71%)和重复性(RSD 1.32%)均符合国家药典(2015版)规定，回收率(80%、100%、120%)分别为 91.51%、97.75%、99.23%，RSD 为 2.67%、1.99%、2.12%。样品在12 h内稳定(RSD 2.41%)，最低检测限为 5.86 ng/mL。所建立方法简单、可靠，可用于各种植物油中角鲨烯的常规检测方法。

图3 角鲨烯总离子流图

2.3.2 维生素E含量

根据方法1.3.4，本实验利用HPLC法对山楂籽油中4种构型的维生素E含量分别进行了测定。由图4和表3可知，山楂籽油中没有β－生育酚，主要为γ－生育酚，它的含量远远大于很多植物油中含量［24］。虽然α－生育酚在维生素E中的活性最高，但是最近研究表明，γ－生育酚可以改善炎症、细胞增殖［25］，降低大肠癌的风险［26］。

表3 维生素E、总多酚、总黄酮含量以及抗氧化活性(n=3)

图4 维生素E HPLC图

通过方法学验证，α－生育酚、γ－生育酚和δ－生育酚的精密度(RSD)分别为 1.06%，、1.09%、0.95%，重复性(RSD)分别为2.34%、1.99%、2.01%。回收率(80%、100%、120%)分别为 101.50% ～103.03%(RSD 1.56% ～2.19%)，99.8% ～103.4%(RSD 1.06% ～1.13%)和97.89% ～102.32%(RSD2.37%～2.56%)。均符合国家药典(2015版)规定。所建立的方法可以准确地检测出植物油中的4种构型维生素E的含量。

2.3.3 总多酚、总黄酮含量及抗氧化活性的测定

植物多酚及黄酮可以清除自由基，具有抗氧化活性。本实验利用紫外分光光度法，测定了山楂籽油中总多酚、总黄酮的含量。实验结果见表3。本实验所用方法经过方法学验证，精密度、重复性、回收率均均符合国家药典(2015版)规定。

山楂籽油中含有丰富的角鲨烯、维生素E、多酚、黄酮类成分，他们都是天然的抗氧化剂，为了进一步评价山楂籽油的抗氧化活性，我们分别用了DPPH和ABTS方法，由表3可知，山楂籽油对DPPH和ABTS的清除能力均达到90%以上，说明山楂籽油有很好的抗氧化性。这为下一步山楂籽油的药效研究提供了借鉴。

3 结论

3.1 利用GC－MS法对山楂籽油主要化学成分进行了研究，结合质谱数据库 (NIST05库)，初步确认了23种主要成分，其中亚油酸、油酸及其脂类是含量最高的成分。除此之外，山楂籽油中还含很多具有抗氧化活性的成分，如角鲨烯(6.11%)、维生素E(1.84%)等。

3.2 利用37种脂肪酸标准品结合质谱数据库，共确定山楂籽油中含有14种脂肪酸。其中不饱和脂肪酸(UFA)多于饱和脂肪酸(SFA)，亚油酸、油酸和棕榈酸为主要脂肪酸，占总峰面积的91%。结果显示山楂籽油的脂肪酸组成有利于我们的健康。

3.3 植物油中含有的具有生物活性的成分往往决定着油是否可以作为功能性食用油进行开发。通过本实验，我们发现山楂籽油中含有多种生物活性物质。我们应用GC－MS法对角鲨烯的含量进行了测定，结果显示山楂籽油含有角鲨烯(236.64±13.20)mg/kg，高于很多功能性植物油。通过HPLC法分别测定了山楂籽油中4个构型维生素E含量。结果表明，山楂籽油中不含有!－生育酚，而γ－生育酚含量最高［(51.92±2.53)mg/100 g］。本实验按照文献［15－16］，分别比较了两种提取溶剂，确定用40%乙醇提取油中总多酚和总黄酮。利用紫外分法测定山楂籽油中总多酚、总黄酮含量分别为(424.59±11.25)、(103.33±5.86)mg REs/100 g DW。这些成分均是天然的抗氧化剂，具有很好的抗氧化活性。

3.4 氧化应激是很多慢性疾病发病的原因之一，开发抗氧化的食品可以对多种疾病起到预防治疗的作用。我们用DPPH和ABTS方法评价了山楂籽油的体外抗氧化性，研究发现山楂籽油对DPPH和ABTS的清除能力均达到90%以上，山楂籽油有很好的抗氧化性。由此看来，山楂籽油作为一种功能性食用油进行开发，具有很大的前景。