不同水分活度下稻谷和糙米黄曲霉毒素累积风险的比较

李凯龙 田 芳 王达能 邓树华 陈 甜 吴树会 周剑宇

(湖南省粮油产品质量监测中心1，长沙 410201)

(郴州市食品药品检验检测中心2，郴州 410201)

谷物是全世界范围内最重要的主食之一，其中88%的消费量和77%的出口集中在亚洲地区。根据2016年国际粮农组织(FAO)的统计，近年来谷物产量稳步增长，糙米产量也突破了49 520万t［1］。因亚热带－热带地区适宜的温湿度条件有利于真菌生长和真菌毒素的污染，使得亚洲地区谷物真菌毒素安全尤为突出。黄曲霉毒素是黄曲霉菌和寄生曲霉菌在生长过程中产生的一类次级代谢产物，在粮食和食品中的主要存在形式包括黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1及 M2等，其中 AFB1的毒性和致癌性最强［2］。所以许多国家和组织制定了食品和饲料中AFB1的最高限量，欧盟规定谷物中AFB1的含量不能超过2 μg/kg，AFs的总量不得超过 4 μg/kg［3］，我国最新国家标准GB 2761—2017中规定玉米及其制品中AFB1的限量为20μg/kg，稻谷、糙米和大米中AFB1的限量为10μg/kg，小麦、大麦及其他谷物中AFB1的限量为5μg/kg。随着谷物消耗量的不断增加，即使是低剂量AFs的潜在污染都会对消费者造成风险。从田间到仓库的不同环节都可能发生由产毒真菌引起的腐败，这取决于一系列相互作用的生物和非生物因素［4－5］。水分活性(aw)是食品质量控制中的一个重要指标。通过利用水分活性可以控制食品微生物的污染，因此，在考虑一种食品的质量与微生物腐败之间的关系时，水分活性是极其有用的［6］。研究表明大多数细菌在水分活度0.91以下停止生长，大多数霉菌在水分活度0.8以下停止生长［7］。所以谷物水分活度对于储藏期谷物的微生物安全至关重要。前人关于稻谷在储藏过程中的霉变研究主要集中在不同水分含量稻谷的霉变规律和霉变防控技术［8－11］，而关于稻谷水分活度与霉变关系的研究以及稻谷和糙米在储藏过程中的霉变风险差异研究较少。本研究旨在通过在实验室对稻谷和糙米接种高产毒黄曲霉菌孢子来模拟黄曲霉菌污染过程，比较不同储藏温度条件下:1)不同水分活度稻谷和糙米霉变过程中呼吸速率和CO2总产量的差异;2)不同水分活度稻谷和糙米霉变过程中干物质损失(DML)的差异;3)不同水分活度稻谷和糙米霉变过程中AFB1累积水平的差异。为稻谷储藏过程中储存形式和水分活度的选择提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

稻谷:2017年产早籼稻，来自湖南长沙霞凝国家粮食储备库，初始水分14.2%;黄曲霉毒素产毒菌株NRRL3357为标准产黄曲霉毒素菌株;AflaStarTMR免疫亲和柱:美国Romer公司。

1.2 主要仪器与设备

安捷伦6890N气相色谱仪、安捷伦1260Infmity高效液相色谱仪(配有荧光检测器和柱温箱):美国Agilent公司;JLG－Ⅱ型砻谷机:中储粮成都粮食储藏科学研究所;水分活度仪:美国 AquaLAB公司;DHG－9140A电热鼓风干燥箱:上海培因实验仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 谷物样品与等温吸湿曲线的绘制

首先在25℃条件下利用美国AquaLAB公司的水分活度仪测定同一批稻谷和糙米的初始水分活度。将已知不同体积的去离子水加入到装有5 g谷物样品的25 mL样品瓶中，样品瓶密封后再在4℃条件下平衡48 h，期间不断振荡摇匀。然后将样品置于25℃平衡后测定水分活度，吸湿样品通过在125℃烘箱中烘干再次称量样品干重计算得到其对应的含水量。最后利用水分活度和含水量数据绘制成同一批稻谷和糙米的等温吸湿曲线，具体方法参照文友先等的方法［12］。

1.3.2 真菌分离和高产毒黄曲霉菌的鉴定和筛选

分离程序:取霉变稻谷粒利用1%次氯酸钠进行表面消毒1 min，清水冲洗30 s，在滤纸上吸干水分后置于麦芽汁琼脂(MEA)培养基和氯硝胺18%甘油(DG18)琼脂培养基上，每种培养基设置5个重复，每个培养皿中培养5粒稻谷粒或糙米粒。用无菌镊子将稻谷粒和糙米粒等距摆放在MEA和DG18培养基上并在25℃恒温培养箱中培养10 d。将黄曲霉菌单菌落再接种到MEA和DG18培养基上，用以确认和随后筛选高产毒黄曲霉菌。

黄曲霉毒素的定性测定:利用椰子琼脂培养基筛选黄曲霉毒素是参考Davis等［13］的方法。培养基制备:将250 mL椰子脂和250 mL去离子水在75℃热搅拌器中混匀后加入10.0 g琼脂粉和0.08 g氯霉素，培养基经高温灭菌后倒入9 cm培养皿中冷却备用。用无菌接种环将每种黄曲霉菌株的孢子悬浮液接种到培养平板上。接种过的培养皿在25℃恒温培养箱中培养7 d，在激发光波长为365 nm的紫外光照射下观察是否存在黄曲霉毒素的特有的蓝色荧光，其中B族产生蓝紫色荧光，G组产生黄绿色荧光［14］。阳性对照为黄曲霉毒素产毒菌株NRRL3357。

AFB1的定量分析参照GB 5009.22—2016方法进行。定量分析结果用于筛选高产毒黄曲霉菌株。

1.3.3 稻谷和糙米感染黄曲霉菌孢子

为了加快谷物霉变速度，本研究在实验室条件下通过接种筛选得到的高产毒黄曲霉菌孢子模拟谷物霉变过程。在培养10 d的高产毒菌株培养平板中加入含0.01%吐温80的无菌水至覆盖整个培养平板，用无菌玻璃棒搅匀培养基表面制备得到黄曲霉菌孢子悬浮液(每个样品制备100μL)。利用血球计数器计数后，孢子悬浮液用无菌水调节孢子溶度为104/mL，也即102个孢子/g样品。预先调节到设定水分活度(0.85、0.90、0.95)的稻谷和糙米接种黄曲霉菌孢子后在25℃和30℃培养箱中储存10 d，每隔24 h取样一次。

1.3.4 气相色谱法测定呼吸作用

黄曲霉菌感染后的稻谷和糙米瞬时呼吸作用测定:将10.0 g感染黄曲霉菌的不同水分活度(0.85、0.90、0.95)稻谷和糙米预先在 4 mL Chromacol自动进样器样品瓶中平衡。然后将这些样品放在用甘油水溶液维持大气相对湿度要求的相对平衡湿度的3 L气室中待用。气相色谱仪使用的是带热导检测器的安捷伦6890N气相色谱仪，载气为氦气。二氧化碳溶度百分比用于计算呼吸速率R(mg·kg－1·h－1)、CO2累积量和干物质损失(DML)。色谱图通过公式计算CO2体积:

式中:10.2代表用于日常校准仪器标准样品的CO2溶度，随后计算呼吸速率R为:

式中:V代表取样过程中增加空气的顶部空间体积(共45 mL);d代表CO2的密度(1.977 mg/mL);m代表样品干重(本实验为0.01 kg);t代表检测持续时间(1 h)。各个条件下干物质损失百分比计算:

式中:T(h)代表实验持续周期(本实验为240 h)。

1.3.5 稻谷和糙米AFB1的提取和定量分析

将10.0 g黄曲霉菌感染后的稻谷和糙米样品在60℃烘干48 h后用实验室粉碎机粉碎后，其中5 g次级样品利用AflaStarTMR免疫亲和柱提取AFB1用于高效液相色谱荧光法的定量分析，AflaStarTMR免疫亲和柱的具体使用方法参见厂家试剂盒说明书。提取纯化的AFB1利用三氟乙酸进行衍生化，然后用1 mL注射器将样品通过0.22 mm滤膜过滤的样品注入液相色谱样品瓶中用高效液相色谱荧光法进行定量分析，定量分析方法参照 1.3.2。

1.3.6 统计分析

利用SPSS软件对数据进行统计分析，两个处理数据采用t检验进行比较，两个以上处理数据采用双因素方差分析(Two－way ANOVA)进行比较，p－values＜0.05视为不同处理具有显著性差异的判定标准。

2 结果

2.1 不同水分活度稻谷和糙米霉变过程中呼吸速率和CO2累积量的比较

通过瞬时呼吸速率计算稻谷和糙米在储藏过程中发生霉变所产生的二氧化碳总量。图1结果表明，发生霉变后随着储存时间的延长稻谷和糙米的呼吸速率和总CO2累积量不断增加，其中0.95水分活度储存稻谷和糙米的呼吸速率和总CO2累积量显著高于0.85和0.90水分活度稻谷和糙米(P＜0.05)。而稻谷和糙米的比较发现，糙米的呼吸速率和总CO2累积量均较稻谷高，其中高水分活度糙米更显著。说明在储藏过程中随着霉变的发生糙米的呼吸速率较稻谷快，其总呼吸量较稻谷多。且谷物水分活度越大，在储存过程中其呼吸速率和总CO2累积量越大。

图1 不同水分活度稻谷和糙米霉变过程中呼吸速率和CO2累积量变化

2.2 不同水分活度稻谷和糙米霉变过程中干物质损失的比较

不同水分活度稻谷和糙米不同储存温度条件下霉变过程中干物质损失的比较结果表明，接种黄曲霉菌后，储存10 d的稻谷和糙米干物质损失率随着谷物水分活度和温度的增加而增加。其中稻谷的干物质损失较糙米少，高水分活度(0.95)稻谷的干物质损失率约为4%而糙米约为15%～20%。有趣的是高水分活度(0.95)稻谷在25℃储存条件下干物质损失率较30℃储存条件下干物质损失率高，这与糙米结果有所差异(图2a，图2b)。

2.3 不同水分活度稻谷和糙米霉变过程中AFB1累积的比较

不同水分活度稻谷和糙米不同储存温度条件下霉变过程中AFB1累积的比较结果表明，接种AFB1后，储存10 d的稻谷和糙米AFB1的含量随着谷物水分活度和储存温度的增加而增加。所有接种过黄曲霉菌的样本储存10 d后检测到的AFB1累积水平都高于我国国家标准中规定的稻谷和糙米中AFB1限量水平(10μg/kg)，但糙米中黄曲霉毒素B1的含量远远大于稻谷中的含量，说明糙米在储存过程中更易发生霉变。在同一谷物水分活度条件下，储存温度的升高会导致AFB1累积量的增加。所以高温高水分活度储存条件有利于黄曲霉菌的生长，导致AFB1污染加重，而糙米较之稻谷更易受黄曲霉菌的侵染，加重AFB1的污染(图2c，图2d)。

图2 不同水分活度稻谷和糙米霉变过程中干物质损失和AFB1累积的比较

干物质损失是霉菌生长消耗造成的，而进一步分析稻谷和糙米霉变过程中干物质损失和AFB1累积量的相关性发现，二者具有高度相关性，其中稻谷和糙米霉变过程中二者的相关系数分别为0.992和0.985 9(图3)，干物质损失由谷物的呼吸速率决定，所以通过谷物的呼吸速率预测谷物霉变过程中真菌毒素累积的风险具有一定的可行性。

图3 不同水分活度稻谷和糙米霉变过程中干物质损失和AFB1累积量的相关性分析

3 讨论

本研究储存10 d的稻谷和糙米干物质损失率随着谷物水分活度和温度的增加而增加的结果与研究人员在燕麦和玉米中发现干物质损失受水分活度显著影响的结果一致［15－16］。而稻谷干物质损失较糙米低，可能是因为稻谷较糙米的呼吸速率低，另稻谷具有保护作用的稻壳，而糙米中的淀粉更容易被真菌所利用导致的［17］。同时，糙米营养物质的高利用率导致了更快的真菌繁殖力，更高的谷物呼吸速率和更多的谷物干物质损失，尤其是在高水分活度(0.95)处理条件下干物质损失更多。有趣的是0.95水分活度稻谷的最大干物质损失率出现在25℃条件下而不是30℃条件，这可能是由于25℃储存条件下是稻谷中自然携带的真菌菌株的最佳生长环境温度导致的。

接种黄曲霉菌孢子的高水分活度稻谷和糙米在储存10 d后AFB1累积量最高。这一结果与AFB1在稻谷中最佳产毒环境范围为温度在25到30℃之间，水分活度接近0.99的研究结果相似［18］。小麦中的研究表明水分活度对AFB1累积量的影响较温度高［19］。但也有些研究表明，温度和水分活度的相互作用条件下由于传毒媒介和菌株品系的不同，AFB1的累积量会不同。而糙米中的毒素累积量大于稻谷再次证明了稻壳对米粒的物理保护作用。对于高温高湿储存条件地区，糙米的品质劣变和毒素污染风险更大，这些地区应采取稻谷储存方式并注意储存环境的湿度变化。

本研究结果还表明谷物的实时呼吸速率用于预测谷物霉变过程中真菌毒素累积的风险具有一定的可行性。大米呼吸作用的实时监测等产后管理措施应该考虑被用作真菌活动的早期指标，以防加工大米受真菌的侵染和毒素累积污染。刘焱等［20］通过对储粮霉变产气与毒素含量变化的相关性进行分析，得出快速生长及产毒菌株的产气会出现明显的加速现象，且产气速率变化时间比产毒时间提前一周左右。所以产气的加速特点可以应用于对实仓中霉变危害的预测，而对毒素的提前预测作用，则可以对储粮中产生毒素的情况进行提前预警，降低储粮受毒素污染的风险。耿旭等［21］也研究了不同生理状态霉菌活动导致粮堆中CO2浓度变化的规律，发现可以通过粮堆CO2浓度变化监测结果了解储粮中霉菌活动的生长状态，从而甄别储粮受霉菌危害的风险程度。所以通过综合谷物加工、真菌侵染、真菌毒素的产生、谷物呼吸速率变化和谷物干物质损失临界条件的研究用于预测谷物储存品质劣变的生物模型可以更好的进行谷物产后储存管理。