籼米中嘉早17储藏过程中蛋白质氧化程度及结构的变化

吴 伟 吴晓娟

(中南林业科技大学食品科学与工程学院;稻谷及副产物深加工国家工程实验室，长沙 410004)

稻谷是我国65%以上人口的口粮，稻谷的储藏和生产直接关系到国家粮食供应体系的安全。早籼稻比中晚籼稻具有更好的耐储藏性，是南方地区储备粮轮换的主要品种。目前，南方地区的稻米产量已经达到中国稻米产量的50%以上［1］。然而作为“第五、七储粮生态区”的广大南方地区，夏季气温通常高达37℃以上、相对湿度高达85%以上，储藏过程中稻米极易陈化变质［2］。

稻米在陈化过程中稻谷的物理、化学和生理性质发生一系列变化，导致稻米食用品质和使用品质下降，最终影响其在市场上的正常流通［3－4］。长期以来，稻米储藏过程中淀粉和脂质含量和结构的变化被视为陈化导致稻米食用品质下降的重要原因，近年来相关研究表明稻米储藏过程中大米蛋白结构和含量的变化也是导致稻米陈化的主要因素之一［3，5］。已有研究表明，随着储藏时间的延长，稻米中的米谷蛋白和醇溶蛋白含量变化不大，清蛋白和球蛋白含量显著下降［6－7］，但关于储藏过程中大米蛋白结构变化的研究报道较少。此外，中国稻米品种繁多，已有研究报道不同品种稻米的蛋白质结构差异较大，崔莎莎［8］研究低水解度大米蛋白的结构时，仅发现β－折叠、无规卷曲和β－转角结构，而缺少α－螺旋结构;易翠平等［9－10］研究碱处理和酸法脱酰胺对大米蛋白结构的影响时，仅发现β－折叠、α－螺旋和β－转角结构，而缺少无规卷曲结构。中嘉早17是目前我国年推广面积最大的籼稻品种［11］。因此，本研究以新收获籼米中嘉早17为原料，采用温度37℃、相对湿度85%进行加速陈化储藏，研究储藏过程中大米蛋白氧化程度及结构的变化，以期为深入探讨籼米的陈化机理提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新收获籼米中嘉早17(国标一级):湖南粮食集团长沙储备分公司;5，5'－二硫代二硝基苯甲酸盐(DTNB)、1－苯氨基萘 －8－磺酸(ANS):美国Sigma－Aldrich公司;低分子量标准蛋白:上海生化试剂公司;甘氨酸(Gly)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)等试剂均为分析纯:国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

RXZ－128A型人工气候箱:宁波市科技园区新江南仪器有限公司;Sorvall LYNX6000型高速冷冻离心机:美国Thermo Fisher公司;LGJ－18型冷冻干燥机:北京四环科学有限公司;722s型可见光分光光度计:上海精密科学仪器有限公司;F7000荧光分光光度计:日本日立公司;SE260型电泳仪:美国GE公司;Nano ZS型纳米粒度分析仪:英国Malvern公司;IRTracer－100型傅里叶变换红外光谱仪:日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 籼米加速陈化储藏

参考王凡等［1］的方法加速陈化储藏，取适量中嘉早17大米(含水量13.48%)置于15 cm×20 cm大小的托盘中，放入人工气候箱中加速陈化储藏，储藏条件为温度37℃、相对湿度85%，每周取样。

1.3.2 大米蛋白制备

参考吴伟等［12］的方法制备大米蛋白，将储藏不同时间的大米磨粉过80目筛，按料液比1∶7(m/V)加入去离子水中，再用2 mol/L NaOH溶液调节pH值至9.0，在40 ℃、120 r/min下搅拌反应4 h，然后将悬浮液在4℃、8 000 r/min下离心20 min，取上清液用2 mol/L盐酸溶液调节pH至4.0，静置20 min，4℃、8 000 r/min离心15 min得到蛋白沉淀，用去离子水洗涤3次后，再将蛋白沉淀分散于4倍体积的去离子水中，用2 mol/L NaOH溶液调节pH 至7.0，透析72 h后冷冻干燥得到纯度为82%的大米蛋白。

1.3.3 大米蛋白羰基含量测定

参考Huang等［13］的方法，采用 2，4－二硝基苯肼比色法测定大米蛋白的羰基含量。称取100 mg左右的大米蛋白分散于5 mL 0.05 mol/L pH 8.0的Tris－HCl缓冲液中，磁力搅拌2 h后在4℃、8 000 r/min下离心30 min，用考马斯亮蓝比色法测定上清液的蛋白浓度，然后将上清液稀释为蛋白质量浓度2.86 ～4.29 mg/mL 的溶液。用移液管量取0.35 mL该溶液置于离心管中，加入1 mL含10 mmol/L 2，4－二硝基苯肼的2 mol/L盐酸溶液混合均匀，以不加2，4－二硝基苯肼为空白对照。将混合液在20℃下水浴2 h后，分别加入0.45 mL 40%的三氯乙酸振荡摇匀，静置20 min后在4℃、8 000 r/min下离心20 min，弃去上清液，使沉淀悬浮于1.5 mL乙醇－乙酸乙酯(1∶1，V/V)混合液中，在 4 ℃、8 000 r/min 下离心20 min，如此重复洗涤沉淀3次。最后将蛋白沉淀悬浮于1 mL 0.1 mol/L含6 mol/L盐酸胍的pH 8.0的Tris－HCl缓冲液中，在37℃下水浴20 min。以空白为对照在367 nm波长校正，以22 000 L/(mol·cm)消光系数计算每毫克蛋白质中羰基衍生物的物质的量。

1.3.4 大米蛋白游离巯基及二硫键含量测定

参考 Beveridge等［14］的方法，采用 Ellman's试剂比色法测定大米蛋白的巯基和二硫键含量。称取120 mg大米蛋白置于烧杯中，加入20 mL 8 mol/L尿素Tris－Gly溶液(pH为8.0)，室温磁力搅拌2 h后在4℃、8 000 r/min下离心30 min，用考马斯亮蓝比色法测定上清液的蛋白浓度。取4 mL上清液加入160μL Ellman's试剂(4 mg DNTB溶于1 mL pH 8.0的Tris－Gly缓冲液)，以不加DNTB为对照，在412 nm波长下测定吸光度，以13 600 L/(mol·cm)消光系数计算游离巯基含量。另取4 mL上清液加入0.2% β－巯基乙醇处理2 h后，再加入8 mL 12%的三氯乙酸沉淀蛋白质1 h，在10 000 r/min下离心10 min，用三氯乙酸溶液重复洗涤沉淀3次后，将沉淀溶于6 mL Tris－Gly缓冲液中，以不加 DNTB为对照，在412 nm波长下测定吸光度，以13 600 L/(mol·cm)消光系数计算总巯基含量。总巯基与游离巯基差值的1/2即为二硫键含量。

1.3.5 大米蛋白表面疏水性测定

参考Huang等［13］方法，采用ANS荧光探针法测定大米蛋白的表面疏水性。称取150 mg大米蛋白分散于10 mL 0.05 mol/L pH 8.0 的 Tris－HCl缓冲液中，磁力搅拌2 h后在4℃、8 000 r/min下离心30 min，用考马斯亮蓝比色法测定上清液的蛋白浓度，然后将上清液稀释为蛋白质量浓度0.005、0.01、0.05、0.20、0.40、0.50 mg/mL 的溶液。取不同蛋白浓度溶液4 mL，分别加入50μL 8 mmol/L ANS溶液，测定荧光强度，激发波长390 nm，发射波长470 nm。以荧光强度对蛋白质浓度作图，外推至蛋白质浓度为0，曲线初始阶段的斜率即为大米蛋白的表面疏水性指数。

1.3.6 大米蛋白傅里叶变换红外光谱的测定

参考Liu等［15］的方法，称取1～2 mg大米蛋白和200 mg KBr混合，研磨均匀后制作透明薄片，采用傅里叶变换红外光谱仪扫描，扫描条件:分辨率4 cm－1，扫描范围 400 ～4 000 cm－1，每个样品扫描32次。通过傅里叶红外解卷积技术提高分辨率，以Peak fit 4.12软件对图谱进行分峰处理。

1.3.7 大米蛋白凝胶电泳

参考Huang等［13］的不连续电泳方法。分离胶质量分数12.5%，浓缩胶质量分数4%，电极缓冲液含0.05 mol/L Tris、0.384 mol/L 甘氨酸、0.1%SDS(pH 8.3)，样品溶解液含2%SDS、5% β － 巯基乙醇、10%甘油、0.02%溴酚蓝、0.01 mol/L pH 8.0 Tris －HCl缓冲液。电泳样品质量浓度1.5 mg/mL，上样量10μL，开始电泳时电流为10 mA，待样品进入分离胶后电流为25 mA。

1.3.8 大米蛋白粒径测定

将大米蛋白分散于0.05 mol/L pH 8.0的Tris－HCl缓冲液中，制备1 mg/mL蛋白液，采用纳米粒度分析仪测定大米蛋白粒径分布。

1.3.9 数据处理

所有实验平行测定3次。数据采用Microsoft excel 2003和Origin 7.5进行处理，结果用“均值±标准偏差”表示。指标比较采用最小显著差异法，取95%置信度(P ＜0.05)。

2 结果与分析

2.1 大米蛋白氧化程度的变化

羰基含量的变化是目前最常用的衡量蛋白质氧化程度的指标。如表1所示，籼米中嘉早17加速陈化过程中，大米蛋白羰基含量呈逐渐上升趋势。第1～6周增加比较缓慢，由初始4.02 nmol/mg上升到4.72 nmol/mg;第 6 ～12 周则显著增加，由 4.72 nmol/mg上升到8.34 nmol/mg。这可能是由于加速陈化过程中稻米中存在的脂肪氧化酶的同工酶，脂肪氧化酶同工酶可催化亚油酸等脂质产生自由基和羰基化合物等活性氧化产物［16］。肉类和大豆蛋白质氧化的大量研究表明，脂质自由基可通过夺氢、加氧、偶合以及裂解等反应，使得蛋白质主肽链断裂、侧链基团氧化以及形成共价交联物;脂质活性氧化产物可与多肽链的侧链基团发生反应，造成多肽链交联［17－18］。因而，籼米中嘉早17加速陈化过程中的蛋白质氧化程度变化趋势与油脂氧化自催化反应类似，遵循开始缓慢而逐渐加快的变化规律。

巯基是最容易被自由基攻击的蛋白质氨基酸残基侧链基团［19］。依据氧化环境和氧化强度的改变，蛋白质巯基可形成二硫键和次磺酸等可逆氧化状态，也可形成亚磺酸和磺酸等不可逆氧化状态［20］。如表1所示，籼米中嘉早17加速陈化过程中，大米蛋白游离巯基含量呈逐渐下降趋势，而二硫键含量无显著变化。这表明，大米储藏过程中，其蛋白质游离巯基主要发生的是不可逆氧化反应，生成了更多的非二硫键共价化合物。

表1 籼米中嘉早17储藏过程中大米蛋白羰基、游离巯基和二硫键含量/nmol/mg

2.2 大米蛋白表面疏水性的变化

表面疏水性反映蛋白质中疏水性氨基酸残基的相对暴露程度，也可以用它来衡量蛋白质的结构变化。如图1所示，第1～10周随着储藏时间延长，中嘉早17大米蛋白的表面疏水性逐渐升高;第10～11周，其表面疏水性无显著变化;第12周，其表面疏水性反而略微下降。前期储藏过程中表面疏水性升高可能是由于在脂质氧化形成的自由基氧化体系中，大米蛋白发生了去折叠反应，使埋藏在蛋白质天然构象内部的脂肪族与芳香族氨基酸侧链基团等疏水性氨基酸残基暴露。储藏后期，大米蛋白表面疏水性不升反降，可能是由于之前暴露的疏水性基团进一步氧化转变为亲水基团，或者是暴露的疏水基团通过疏水相互作用形成了聚集体［21］。

图1 籼米中嘉早17储藏过程中大米蛋白表面疏水性的变化

2.3 大米蛋白二级结构的变化

参考Liu等［15］的方法对大米蛋白的去卷积酰胺Ⅰ带谱峰(如图2所示)进行鉴定，β－折叠结构:1 618、1 624、1 630、1 636 和1 684 cm－1;无规卷曲结构:1 645 cm－1;α－螺旋结构:1 655和1 660 cm－1;β－转角结构:1 670和 1 676 cm－1。采用 Peak fit 4.12对酰胺Ⅰ带图谱进行分峰拟合处理，得到大米蛋白的二级结构组成(如图3所示)。随着中嘉早17储藏时间的延长，大米蛋白β－折叠结构相对含量显著降低，无规卷曲和β－转角结构相对含量逐渐增加，α－螺旋结构相对含量无显著变化。有序的β－折叠逐渐向无序的无规卷曲和β－转角结构转变，这表明籼米中嘉早17加速陈化储藏导致大米蛋白二级结构稳定性降低。

图2 籼米中嘉早17储藏过程中大米蛋白傅里叶变换红外光谱酰胺Ⅰ带

图3 籼米中嘉早17储藏过程中大米蛋白二级结构组成的变化

2.4 大米蛋白亚基结构的变化

大米蛋白的主要成分为谷蛋白和醇溶蛋白，其含量占大米蛋白总量的80%以上。醇溶蛋白亚基由单肽链通过分子内二硫键连接而成，其相对分子质量在7～12.6 ku之间［22］。相对分子质量21 ～22 ku为谷蛋白碱性亚基，34～37 ku为谷蛋白酸性亚基，51 ku为谷蛋白低分子聚肽［23］。如图4所示，随着储藏时间的延长，大米蛋白凝胶电泳图谱没有出现新的谱带，但储藏10周以后，谷蛋白碱性亚基、谷蛋白酸性亚基带、谷蛋白低分子聚肽的颜色明显变浅，而分离胶顶部的颜色逐渐加深。这可能是由于大米蛋白中巯基含量较高，巯基在脂质自由基和脂质过氧化产物的氧化下发生分子内或分子间交联，使谷蛋白形成分子质量超过100 ku的聚集体。储藏12周时大米蛋白氧化聚集体的大量产生，可能正是导致其表面疏水性不升反降的重要原因。而醇溶蛋白亚基带的颜色则先变浅后变深，这可能是由于较低浓度的脂质过氧化产物会诱导醇溶蛋白亚基聚集，但较高浓度的脂质过氧化产物也可能导致蛋白质组分部分降解［24］。

图4 籼米中嘉早17储藏过程中大米蛋白亚基结构的变化

2.5 大米蛋白粒径分布的变化

中嘉早17储藏过程中大米蛋白粒径分布的变化如图5所示，随着储藏时间的延长，大米蛋白粒径逐渐增加，这表明储藏过程中大米蛋白形成了可溶性聚集体。吴伟等［25］在储藏时间对米糠蛋白结构影响的研究中，也发现随着储藏时间的延长米糠球蛋白形成了水溶性聚集体。如前所述，这可能是由于籼米中特有的脂肪氧化酶同工酶催化残余脂质形成了活性脂质氧化产物，进一步诱导大米蛋白氧化形成了聚集体，从而使得粒径不断增加。

图5 籼米中嘉早17储藏过程中大米蛋白粒径分布的变化

3 结论

籼米中嘉早17经过为期12周的加速陈化储藏，制备的大米蛋白发生了一定程度的氧化和结构变化。储藏过程中，大米蛋白氧化程度的变化趋势与油脂氧化自催化反应类似，遵循开始缓慢而逐渐加快的变化规律，主要表现为蛋白质羰基含量不断增加，游离巯基含量不断减少，二硫键含量无显著变化。游离巯基主要发生的是不可逆氧化反应，生成了更多的非二硫键共价化合物。同时，大米蛋白表面疏水性则呈现先升高后缓慢降低的趋势。傅里叶变换红外光谱分析表明，大米蛋白二级结构中有序的β－折叠逐渐向无序的无规卷曲和β－转角结构转变，蛋白质氧化导致大米蛋白二级结构稳定性降低。凝胶电泳和粒径分析结果均表明，籼米中嘉早17储藏过程中，蛋白质氧化导致大米蛋白形成了氧化聚集体。